《International Journal of Molecular Sciences》：Salivary miR-324-5p Is Associated with Periodontal Inflamed Surface Area in People Living with HIV Receiving Antiretroviral Therapy: A Case–Control Study
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摘要
牙周炎是一种常见的炎症性疾病，影响牙齿支持组织。细胞外囊泡（EVs）中的唾液微小RNA（miRNA）表达可反映牙周状态。人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者中牙周炎的患病率和严重程度均较高。本研究旨在识别接受抗逆转录病毒治疗（ART）的HIV感染者（PWH）
摘要
牙周炎是一种常见的炎症性疾病，影响牙齿支持组织。细胞外囊泡（EVs）中的唾液微小RNA（miRNA）表达可反映牙周状态。人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者中牙周炎的患病率和严重程度均较高。本研究旨在识别接受抗逆转录病毒治疗（ART）的HIV感染者（PWH）中与牙周炎相关的唾液EVs中的miRNA。病例组由接受ART且患有牙周炎的PWH组成，对照组则包括患有牙周炎但未感染HIV的个体。研究分两个阶段进行。在第一阶段，通过下一代测序分析在病例组中识别出特定miRNA，最终选定hsa-miR-324-5p作为牙周炎的候选标志物。在第二阶段，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）评估病例组中hsa-miR-324-5p的miRNA表达与牙周状态之间的关联。RT-qPCR分析表明，hsa-miR-324-5p表达与牙周炎性表面积（PISA）显著相关。生物信息学分析确定了hsa-miR-324-5p的10个潜在枢纽基因，这些基因参与蛋白激酶结合，并与黏附连接通路相关，可能参与牙周炎的发病机制。源自EVs的唾液hsa-miR-324-5p可能与接受ART的PWH中牙周炎的严重程度相关。
论文解读：唾液miR-324-5p与接受抗逆转录病毒治疗的HIV感染者牙周炎严重程度的关联研究
一、研究背景与目的
牙周炎是一种慢性多微生物炎症性疾病，以宿主免疫反应失调为特征，导致结缔组织和牙槽骨的进行性破坏，若不加治疗最终可能导致牙齿脱落。牙周炎的诊断依赖于临床参数，包括临床附着丧失（CAL）、牙周探诊深度（PPD）和探诊出血（BOP），以及牙槽骨丧失的影像学评估。牙周炎性表面积（PISA）作为一种定量指标，可估算出血的牙周袋上皮总表面积（mm2），由PPD和BOP计算得出，能够更精确地评估牙周疾病的严重程度和炎症状态。慢性牙周炎影响约30%的普通人群，重度广泛型牙周炎在全球发生率为5%–15%，是牙齿脱落的主要原因。
已有研究表明，全身性疾病可影响牙周炎，包括糖尿病、肥胖、HIV感染或获得性免疫缺陷综合征（AIDS）等。抗逆转录病毒治疗（ART）显著减少了HIV感染者的机会性感染，降低了死亡率，改善了生存率和生活质量。然而，ART本身也可能对HIV感染者（PWH）产生不良影响。接受ART的HIV感染儿童牙周疾病患病率显著升高（OR = 3.11, 95% CI 1.62–5.97）。然而，接受ART的PWH中miRNA在牙周炎中的作用机制尚不清楚。
唾液富含细胞外囊泡（EVs），与血液和脑脊液等其他体液相比，唾液提供了一种非侵入性、易于获取且成本效益高的采样方式。EV相关miRNA对疾病检测和监测具有更高的稳定性和诊断可靠性。本研究假设来自唾液EVs的miRNA可能在接受ART的PWH牙周炎中发挥作用，并采用两阶段研究设计验证该假设。
二、研究设计与方法
本研究为病例对照研究，于2024年8月至2025年4月在冈山大学医院开展。病例组为接受ART且诊断为牙周炎的HIV感染者，对照组为未感染HIV的牙周炎患者，对照组与病例组在年龄、性别和牙周状态方面进行匹配。研究遵循流行病学观察性研究报告规范（STROBE）指南。
研究分为两个阶段。第一阶段为发现阶段，对病例组和对照组的配对参与者进行口腔检查、临床变量数据采集和唾液样本收集，采用下一代测序（NGS）分析识别两组中差异表达候选miRNA。第二阶段为验证阶段，纳入一组患有牙周炎的PWH队列，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证所选miRNA的表达及其与牙周状态的关联。
唾液样本采集要求参与者在采集前至少1小时禁食、禁饮或进行口腔卫生操作，于支持性牙周治疗前12:00至16:00之间通过被动流涎法收集非刺激性全唾液。所有样本立即于?80°C保存。口腔检查由同一位牙医完成以确保一致性，评估参数包括PPD、BOP、PISA、口内牙齿数和菌斑控制记录（PCR）。EVs分离采用基于磁珠的MagCapture Exosome Isolation Kit PS Ver.2试剂盒。EVs形态和表面标志物通过免疫金透射电子显微镜（TEM）验证。RNA提取采用Norgen Exosomal RNA Isolation Kit。小RNA文库构建采用NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set，在Illumina NovaSeq 6000平台进行单端测序（SE50）。差异表达分析使用edgeR包，以|log?FC| > 2为差异表达标准。RT-qPCR采用TaqMan MicroRNA Assays验证hsa-miR-324-5p表达，以U6作为内参。靶基因预测使用TargetScan、miRWalk和miRDB三个数据库的交集，lncRNA相互作用通过ENCORI数据库识别，ceRNA网络使用Cytoscape构建，蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络通过STRING数据库生成，枢纽基因通过cytoHubba识别，功能富集分析使用DAVID进行。
三、研究结果
3.1 唾液EVs特征
透射电子显微镜显示分离的唾液EVs呈现典型的杯状形态，免疫金TEM确认了EV表面标志物CD9和CD63的存在。
3.2 第一阶段研究：NGS分析
第一阶段共纳入病例组和对照组各12名参与者。NGS分析共检测到201个两组间差异表达的miRNA，其中144个miRNA因在对照组中表达水平为零而被筛选出来。根据log?FC值（6.63），选择hsa-miR-324-5p作为牙周炎的候选标志物。
3.3 第二阶段研究：RT-qPCR验证
RT-qPCR分析显示，病例组中唾液EV来源的hsa-miR-324-5p表达与PISA显著相关（p = 0.028）。年龄、PPD、BOP、CD4计数和ART持续时间与miR-324-5p表达无显著关联。10名PWH接受比克替拉韦+替诺福韦艾拉酚胺治疗，5名PWH接受多替拉韦+替诺福韦艾拉酚胺作为ART药物。
3.4 调控网络与功能分析
共鉴定出88个mRNA和36个长链非编码RNA（lncRNAs）作为hsa-miR-324-5p的潜在靶标，基于这些相互作用构建了竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络。STRING数据库生成的PPI网络包含47个节点和31条边，cytoHubba分析确定了10个关键枢纽基因，枢纽基因亚网络包含10个节点和15条边。基因本体（GO）分析表明这些基因主要定位于细胞内和细胞质区室，包括FAR/SIN/STRIPAK复合物，可能显著参与细胞内信号转导，特别是蛋白结合和蛋白激酶活性。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示在黏附连接和Rap1信号通路显著富集。10个枢纽基因中，FARP2、RAP1A、PDCD10、KRIT1、FYN五个基因参与黏附连接通路，FARP2、RAP1A、KRIT1、SKAP1四个基因参与Rap1信号通路。
四、讨论与结论
研究人员推测hsa-miR-324-5p可能通过抑制KRIT1、RAP1A、ITGB1BP1、FYN和PDCD10的表达，破坏内皮和上皮屏障完整性，增加其通透性，并激活炎症信号通路，这些改变可能共同促进接受ART的PWH中牙周炎的发病或加重其严重程度。miR-324-5p已被证明可影响多种炎症反应，在胰腺癌、胃癌等多种疾病中发挥作用。
本研究存在以下局限性：首先，这是病例对照研究，需要队列研究和干预研究来更详细地研究ART中PWH牙周炎的机制；其次，miRNA分析的发现阶段基于每组12名参与者的混合RNA样本，每组仅生成一个测序文库，无生物学重复，差异表达分析应视为探索性候选鉴定而非正式统计学证据；第三，本研究无法识别未接受ART的牙周炎PWH；第四，PWH参与者数量相对较少，可能限制统计效能和结果的普适性；第五，由于日本PWH数量有限，纳入所有符合标准的参与者，未排除具有潜在混杂因素的个体，如糖尿病、高血压、饮酒和吸烟。
研究结论：本研究证明从唾液EVs中鉴定的hsa-miR-324-5p与接受ART的PWH中的PISA相关。生物信息学分析预测hsa-miR-324-5p的靶基因可能参与蛋白激酶结合、Rap1信号通路和黏附连接动力学。这些发现为hsa-miR-324-5p在牙周疾病中的潜在生物学功能提供了假说，但并未确立其在牙周炎进展中的因果作用。该论文发表于《International Journal of Molecular Sciences》。未来可能需要进一步的实验研究来验证这些预测的靶基因并阐明潜在的分子机制。
