利用皮质类器官阐明DEAF1在神经发育中的作用及高风险自闭症基因间的共享分子通路

《SCIENCE ADVANCES》：Elucidating the role of DEAF1 in neurodevelopment and shared molecular pathways in high-risk autism genes using cortical organoids

　　

神经发育障碍(NDD)包括自闭症谱系障碍(ASD)和智力障碍(ID)，具有高度遗传异质性。DEAF1已成为关键NDD风险基因，其致病变异与DEAF1相关神经发育障碍(DAND)相关，但其在人神经发育中的作用不清。人皮质类器官(hCO)可生理相关地模拟胎脑发育并保留人遗传背景。研究人员显示，人胚胎干细胞(hESC)中的DEAF1突变破坏神经元基因位点染色质可及性，引起显著转录改变。在hCO中，该突变导致前体细胞增殖异常、皮质板层紊乱和神经元分化受损。进一步，研究人员在多种ASD相关遗传扰动中鉴定出WNT信号、TGFβ超家族信号和细胞周期调控为共同失调通路。用Porcupine抑制剂进行WNT信号药理抑制，可部分挽救DEAF1突变hCO的表型缺陷。研究发现DEAF1是神经发育的关键调节因子，并支持面向通路、突变非依赖的ASD及相关障碍治疗策略。

研究背景方面，神经发育障碍(NDD)如自闭症谱系障碍(ASD)、智力障碍(ID)等具有强遗传基础，但基因高度异质。DEAF1是高风险的ASD/ID相关基因，编码含锌指结构域、具序列特异性的转录因子，其SAND（Sp-100、AIRE、NucP41/75和DEAF1）结构域对DNA结合和转录活性至关重要。已有动物模型提示DEAF1缺失可致神经管缺陷、围产期死亡及认知缺陷，但DEAF1在人神经发育中的功能仍研究不足。人皮质类器官(hCO)由人多能干细胞(hPSC)衍生，能重现早期脑发育的细胞多样性、空间组织和基因表达动态，为研究人特异神经发育过程提供模型。因此，研究人员利用hCO阐明DEAF1功能并探索不同ASD基因是否共享分子机制，该论文发表于《SCIENCE ADVANCES》。

关键技术方法方面，研究人员使用CRISPR/Cas9在人胚胎干细胞(hESC)引入DEAF1 SAND结构域杂合功能缺失突变，并以CRISPR干扰(CRISPRi)诱导DEAF1敲低；样本为人胚胎干细胞来源皮质类器官及已发表的36个高风险ASD基因脑类器官单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据（CHOOSE系统）。主要技术包括染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)、转座酶可及染色质测序(ATAC-seq)、RNA测序(RNA-seq)、钙成像、多电极阵列(MEA)、类器官融合实验、OrgaLink微通道芯片连接实验，以及激酶抑制剂(KI)筛选。

研究结果如下。The DEAF1 mutation reduces open chromatin accessibility in neuronal genes：研究人员通过ChIP-seq鉴定DEAF1结合基因富集于神经发育过程，ATAC-seq显示DEAF1^+/?人胚胎干细胞中1667个基因（Cluster A）染色质更闭合，涉及轴突发生、突触组装、前脑发育；POU3F2、ATOH1、GSK3B启动子可及性下降；仅部分Cluster A基因为DEAF1直接结合，提示多为间接调控，并富集homeobox与bHLH家族转录因子 motif，表明DEAF1突变改变染色质可及性而影响神经发育转录因子结合与基因表达。

The DEAF1 mutation affects radial glial cell proliferation and disrupts cortical plate formation：在hCO中，DEAF1^+/?类器官后期更小但脑室区(VZ)样结构增大，SOX2阳性区增加；KI67阳性细胞增多，基底放射状胶质细胞(bRGC)标记HOPX下降，第70天凋亡增加；细胞分裂角度分析显示垂直（对称自我更新）分裂增多，斜向和水平（不对称分化）分裂减少；中间前体细胞(IPC)标记EOMES减少；深层(DL)标记CTIP2过多、浅层(SL)标记SATB2减少，皮质板层分布异常，说明DEAF1突变破坏前体增殖与分化平衡，放射状胶质细胞蓄积并损伤神经元分化。

The DEAF1 mutation disrupts neuronal development and function：D70 hCO的RNA-seq显示两组明显分离，hCO转录与8至24 post-conception weeks(PCW)人胎脑吻合，DEAF1^+/?差异表达基因(DEG)与ASD风险基因关联最强（r=0.82）。共2064个DEG，下调基因富集于神经元投射发育、突触组装；背/腹侧前脑身份未变，抑制性神经元标记低，说明DEAF1主要损害神经元发育与突触相关程序，而非区域模式。

Disruptions in neuronal activity and function in DEAF1^+/? hCOs：钙成像显示DEAF1^+/?神经元钙活动振幅与频率降低；DEAF1敲低类器官频率也下降。MEA记录显示局部场电位(LFP)动作电位更少，爆发(burst)间隔延长、每爆发尖峰数增加、爆发时长延长，通道间相关减弱，网络同步受损，表明DEAF1突变改变神经元活动、网络连通性。

Disruptions in neuronal morphology and connectivity in DEAF1^+/? hCOs：Sholl分析显示DEAF1^+/?神经元树突交叉减少、树突长度变短；GFP与tdTomato标记类器官融合实验显示双向投射减弱；OrgaLink芯片中DEAF1^+/?轴突束形成效率降低；轴突导向与形成基因表达下降，说明树突形态、轴突投射和长距离连接均受损。

Identification of dysregulated key neurodevelopmental signaling pathways as a shared feature in ASD：研究人员整合本研究与Li等CHOOSE的36个ASD基因scRNA-seq数据，发现27/36扰动使神经前体细胞(NPC)增加；WNT信号在31/36上调，TGFβ超家族信号在34/36上调，细胞周期调控在33/36上调。DEAF1^+/?中WNT3A、WNT4、WNT5A、BMP4、SMAD3、CCND2等上调，GSK3B可及性降低。结果表明WNT、TGFβ超家族、细胞周期调控是ASD遗传异质下的共享失调通路。

Rescue of Proliferation-Differentiation Imbalance in DEAF1^+/? hCOs through WNT pathway modulation via porcupine inhibition：研究人员用临床期或FDA批准KI筛选，发现Porcupine抑制剂Zamaporvint可恢复类器官大小；200 nM处理使SOX2阳性区与VZ面积缩小，KI67下降，垂直分裂减少、斜向/水平分裂增加，EOMES阳性细胞增多，NeuN与MAP2部分恢复，但神经元活动与突触功能相关基因未被挽救，说明PORCN抑制可部分恢复增殖-分化平衡，但功能恢复不完全。

讨论部分总结：研究人员指出，DEAF1作为序列特异性转录因子，可直接界定靶基因，其突变通过染色质可及性改变使前体动态偏向扩增、bRGC减少、浅层神经元生成受损。跨36个ASD基因可见WNT、TGFβ超家族、细胞周期通路共同失调并导致NPC扩张，支持ASD共同神经发育机制。Zamaporvint通过抑制WNT配体分泌（而非全局抑制β-catenin）更精准，但单通路不足以恢复突触与网络功能，需联合促突触成熟或连接干预。局限包括：所建杂合框移突变表型近似双等位基因/DAND遗传型，应引入患者来源诱导多能干细胞(iPSC)；hCO以背侧前脑为主，抑制性神经元少，难以评估兴奋/抑制(E/I)平衡；长期疗效与体内转化需验证。

研究结论部分翻译：总之，本研究证明DEAF1是神经发育的关键调节因子，并提供证据表明其功能障碍会导致皮质结构破坏与神经元网络缺陷。通过鉴定多种ASD连锁遗传扰动中的共同失调通路，研究人员为开发可适用于遗传异质ASD病例的靶向干预提供了框架。此外，研究人员证明对失调通路的药理靶向可部分挽救ASD相关表型。这些发现为未来研究搭建了桥梁，将遗传异质性与共同神经发育机制联系起来，并最终指导ASD及相关神经发育障碍靶向治疗策略的发展。