人骨髓外（ex vivo）骨 marrow 亚生态位影响人抗体分泌细胞命运

《SCIENCE ADVANCES》：Ex vivo bone marrow subniches influence the fate of human antibody-secreting cells

　　

长期体液免疫依赖于骨 marrow（BM）中的长寿命浆细胞（plasma cells, PCs）。然而，调控浆细胞在人BM生态位内运输、定位与长寿的过程仍知之甚少，尤其体现在人源系统中。现有知识多来自小鼠研究或有限人源模型，难以直接转化至人生物学。研究人员在此提出一种具生理相关性的人骨 marrow-on-a-chip（hBMOC）模型，用于探究人免疫类器官来源的抗体分泌细胞（antibody-secreting cells, ASCs）在人BM微环境中的行为与互作。该hBMOC具微血管并可灌流，同时整合骨内膜（endosteal）与血管周围（perivascular）生态位。研究人员证明，人ASCs经血管迁移，在血管周围区域聚集成簇，并与关键存活因子紧密关联；骨内膜生态位显著影其人ASCs存活、运动与滞留，凸显人BM亚生态位间动态互作对ASC活性的调控。研究人员还观察到一部分人ASCs呈现受CXCR4-CXCL12信号部分调控的stop-and-go迁移模式。这些发现直接揭示此前定义不清的人ASC生物学特征，包括其在三维人BM微环境中的生态位特异性定位、存活与迁移动力学，并强调血管周围与骨内膜区室在支撑人ASC命运中的协同与特异作用，为疫苗持久性、浆细胞老化及疾病相关失调研究奠定基础。

研究背景方面，长期体液免疫依赖骨 marrow（BM）中长寿命浆细胞（plasma cells, PCs），但人源系统中浆细胞如何定位、运输并维持长寿仍不清楚。传统知识主要来自小鼠模型或二维人BM细胞培养，缺乏可在三维人源微环境中解析抗体分泌细胞（antibody-secreting cells, ASCs）与亚生态位互作的平台，也缺乏可稳定生成人ASCs并解构BM亚生态位的系统，因此难以研究人ASC在原生BM中的时空行为。为突破这两大瓶颈，研究人员构建人骨 marrow-on-a-chip（hBMOC）模型，并联合人淋巴类器官来源ASCs，在体外重构人BM亚生态位以研究ASC命运。

该论文发表于《SCIENCE ADVANCES》。作者为开展研究用到几个主要关键技术方法：以人扁桃体或外周血单核细胞（PBMCs）构建生物材料基人淋巴类器官，在PEG-4MAL合成水凝胶中重现生发中心（germinal center, GC）反应并高效产生ASCs；构建五通道微流控hBMOC器件并贴底无缝整合至无底96孔板，分别用间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs）成骨分化建立骨内膜层、用脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）与MSCs在胶原-纤维蛋白水凝胶中形成可灌流血管网络；样本来源于人扁桃体供体及商品化PBMCs。平台具模块化特点，可增减MSCs、骨内膜层或仅留HUVECs以比较亚生态位功能。

研究结果如下。

hBMOC recapitulates subniche microarchitecture of human BM：研究人员通过免疫染色与共定位分析证明，hBMOC中骨内膜层表达骨钙素、骨桥蛋白、CXCL12，血管周围区出现Collagen-IV、硫酸乙酰肝素、VCAM-1与CXCL12，且CXCL12经硫酸乙酰肝素固定于基底膜；模型重现人BM内骨基质相关、血管基底膜相关与骨髓实质相关蛋白的空间分层。

ASCs traverse the vasculature to localize in the perivascular niche of the hBMOC：研究人员将淋巴类器官来源CD19⁺细胞经介质通道载入hBMOC，时序成像显示ASCs经血管进入中央通道并在管周减速滞留，4天后于血管周围聚集成簇，符合体内PC偏好血管周围定位的特征。

ASCs occupy perivascular niche in contact with hBMOC survival and adhesion ligands：空间距离分析显示，ASCs与CXCL12⁺信号平均距离约0.20 μm、与VCAM-1⁺信号约0.42 μm，均显著近于随机分布，说明ASCs定位于血管周围并紧邻CXCL12与VCAM-1等存活和黏附配体。

BAFF and IL-21 promote ASC survival in the hBMOC：在培养基加入BAFF与IL-21后，4天内ASCs数量显著升高，CD138⁺ PCs增多，抗H1N1 IgG分泌细胞增加；CD138⁺细胞Ki67低表达，呈现成熟ASC特征。

ASCs mature during extended culture in the hBMOC：培养延至12天时ASC总数下降但CD138⁺比例升至约56%，CD19^lo群体增加，HLA-DR与Ki67下调、Bcl-2上调，表明hBMOC支持ASC向成熟PC表型演化。

Extravasated ASCs survive in the hBMOC：分选纯ASCs与非ASCs后载入器件，纯ASCs组回收更多ASC且CD138⁺更高、HLA-DR与Ki67更低，证明设备中表型变化来自原有ASC成熟而非非ASC转分化。

Endosteal and perivascular compartments of the BM niche contribute to ASC motility and abundance：单细胞追踪显示约25%细胞高动，呈stop-and-go；去除骨内膜层后高动细胞比例上升、速度增加，ASCs与抗体分泌细胞减少，IL-6与CXCL12表达下降，说明骨内膜与血管周围成分共同调控ASC运动、丰度和存活。

CXCL12-CXCR4 signaling controls ASC motility in human BMOC：用CXCR4拮抗剂AMD3100或抗CXCL12抗体阻断信号后，ASC运动增强、聚簇减少；在CXCL12梯度下细胞趋向性增强，而AMD3100使该反应消失，表明均匀CXCL12起滞留作用、梯度CXCL12起趋化作用，CXCR4-CXCL12信号部分控制人ASC运动。

讨论部分总结：研究人员指出，hBMOC联合人免疫类器官可研究人ASC成熟、空间组织与运动，模型重现血管周围聚集、ECM固定CXCL12、12天内PC样成熟及stop-and-go迁移。由于人BM无法实用化活体时序成像，结论需以小鼠研究为背景解释但不能假定种属一致；人鼠PC在转录因子、受体方面相似，但人PC异质性强、BM架构不同。局限包括未控缺氧、器件10至12天后血管网络过生长且不稳，难以研究超长期PC维持。该平台可用于疫苗持久性、骨髓瘤与自身免疫病建模及药物筛选。

研究结论部分翻译：使用hBMOC平台并整合人免疫类器官来源ASCs，研究人员探索了人ASCs在BM生态位中的成熟、空间组织与运动。结果表明，扁桃体B细胞经GC反应形成ASCs并可转入hBMOC；这些ASCs在血管周围区聚簇，紧邻CXCL12与VCAM-1等调控存活和滞留的黏附分子及细胞因子。分泌型CXCL12通过结合硫酸乙酰肝素等蛋白聚糖固定于ECM，主要位于hBMOC血管网络基底膜。ASCs在三维BM生态位中可存留达12天，逐渐成熟为PC样表型。研究人员验证了多种BM生态位细胞类型对支持ASCs的必要性，并发现部分ASCs具运动性，呈现类似小鼠的stop-and-go模式，该运动受CXCR4-CXCL12信号部分调控。