《Cancers》：The Role of Circulating Extracellular DNA in Patients with Bladder Cancer: Clinical Associations and Exploratory Links with Heart Rate Variability
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背景：细胞外DNA（extracellular DNA）是肿瘤负荷和系统性炎症的一种有前景的生物标志物。然而，其在尿路上皮癌中的临床意义仍不清楚。本研究评估了膀胱癌（bladder cancer, BC）患者与健康对照者血浆中的细胞外DNA（核和线粒体部分）及
背景：细胞外DNA（extracellular DNA）是肿瘤负荷和系统性炎症的一种有前景的生物标志物。然而，其在尿路上皮癌中的临床意义仍不清楚。本研究评估了膀胱癌（bladder cancer, BC）患者与健康对照者血浆中的细胞外DNA（核和线粒体部分）及DNase活性，并探讨了它们与肿瘤分期、生存率以及作为自主神经调节非侵入性标志物的心率变异性（heart rate variability, HRV）之间的关联。方法：研究人员前瞻性分析了84名受试者：63名尿路上皮癌患者（52名非肌层浸润性膀胱癌[non-muscle-invasive bladder cancer, NMIBC]；11名肌层浸润性膀胱癌[muscle-invasive bladder cancer, MIBC]）和21名健康对照者。通过荧光法定量血浆细胞外DNA，同时通过实时定量PCR评估核DNA（nuclear DNA, ncDNA）和线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）部分。DNase活性采用单径向酶扩散法测定。通过组间比较、多变量逻辑回归、生存分析以及与HRV参数的相关性来评估临床关联。结果：与健康对照者相比，BC患者的细胞外DNA略微但显著升高（高出9%）；ncDNA显示出类似趋势。在疾病进展方面，ncDNA与肿瘤分期的关联比总细胞外DNA更强，在MIBC患者中观察到最高浓度。在调整年龄、BMI、性别、吸烟和饮酒的多变量逻辑回归模型中，细胞外DNA仍与BC状态独立相关（OR 5.99，95% CI 1.43–25.12，p = 0.015）。对数转换的ncDNA也与BC状态相关，尽管该模型受缺失数据限制。按细胞外DNA、ncDNA、mtDNA或DNase活性的截断值分层时，未观察到总生存期的显著差异。值得注意的是，虽然细胞外DNA与健康个体的多个HRV参数显著相关（经FDR校正后），但在BC患者中这种生理偶联缺失。结论：循环细胞外DNA和ncDNA与BC独立相关，其中ncDNA与肿瘤分期显示出更强的相关性。虽然在该队列中未确认其生存预后价值，但患者中细胞外DNA–HRV相关性的缺失（而健康对照中显著相关）提示循环DNA与自主神经调节之间生理偶联的丧失。需要进一步的纵向研究来验证这些标志物的临床效用和生物学解释。
**论文解读：循环细胞外DNA在膀胱癌中的临床关联与自主神经偶联探索**
膀胱癌（bladder cancer, BC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，每年新发病例超过60万例，死亡超过22万例。其中尿路上皮癌约占90%，临床上主要分为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer, NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer, MIBC），后者具有更高的进展、转移和死亡风险。尽管膀胱镜、影像学和病理学评估不断进步，仍迫切需要微创生物标志物以实现早期检测、生物学风险分层以及监测肿瘤相关的全身性改变。近年来，循环细胞外DNA（extracellular DNA）作为液体活检的重要组分受到广泛关注，其通过凋亡、坏死、主动分泌、中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps, NETs）形成及肿瘤细胞脱落进入循环，反映肿瘤负荷、组织损伤、炎症和免疫激活等多种过程。然而，细胞外DNA并非生物学均一的实体，核DNA（nuclear DNA, ncDNA）和线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）可能提供互补的临床信息。此外，脱氧核糖核酸酶（DNase）介导的清除机制影响循环DNA的持久性，进而调节其炎症和免疫效应。同时，癌症被视为一种全身性疾病，自主神经系统与炎症通路之间存在双向神经免疫调节，心率变异性（heart rate variability, HRV）作为无创性自主神经功能指标，在肿瘤患者中常降低。因此，研究人员开展了一项前瞻性研究，系统评估BC患者血浆中细胞外DNA及其核和线粒体部分、DNase活性，并探索其与肿瘤分期、生存率以及HRV参数的关联，旨在阐明循环DNA与自主神经调节之间的生理偶联是否在恶性肿瘤中发生改变。
该研究发表于《Cancers》。研究人员于2021年11月至2023年12月期间招募了84名受试者，包括63例尿路上皮癌患者（52例NMIBC、11例MIBC）和21名健康对照者，中位随访34.7个月。研究采用荧光法定量总细胞外DNA，通过实时定量PCR分别扩增β-珠蛋白基因和线粒体D-loop区域以测定ncDNA和mtDNA浓度（以基因组当量表示），使用单径向酶扩散法测定DNase活性。HRV分析基于1000 Hz采样频率的心电记录，选用RMSSD、高频功率（HF）、低频功率（LF）、减速能力（DCmod）和加速能力（ACmod）等参数。统计学方法包括Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验、多变量逻辑回归、Kaplan-Meier生存分析以及Spearman相关分析和Fisher r-to-z变换的组间相关系数比较。
**3.1 循环DNA浓度及其与肿瘤分期的关联**：通过对比BC患者与健康对照的循环DNA水平，发现BC患者的对数转换细胞外DNA浓度显著高于对照（中位对数值2.77 vs. 2.54，p = 0.021），对数转换ncDNA也呈现类似升高趋势，而DNase活性和对数转换mtDNA无显著组间差异。进一步按对照组、Ta期、T1期和MIBC分组的分析显示，ncDNA在不同组间存在明确统计学差异，其中MIBC患者浓度最高，提示ncDNA较总细胞外DNA与肿瘤分期的关联更为稳健。
**3.2 逻辑回归分析**：单变量逻辑回归显示，对数转换细胞外DNA（OR = 3.88）、对数转换ncDNA（OR = 1.44）及每日饮酒（OR = 2.87）与BC状态相关。经年龄、BMI、性别、吸烟和饮酒等协变量调整并采用向后消除法后，对数转换细胞外DNA仍与BC独立相关（OR = 5.99，95% CI 1.43–25.12，p = 0.015），对数转换ncDNA也保持独立关联（OR = 1.87，95% CI 1.01–3.47，p = 0.048）。这表明循环细胞外DNA及其核部分是BC存在的独立相关因素。
**3.3 循环细胞外DNA与所选HRV参数的关联**：在健康对照组中，Spearman相关分析显示，对数转换细胞外DNA与DCmod、RMSSD和对数转换HF呈显著负相关（rho分别为-0.51、-0.51和-0.47，经FDR校正p均小于0.05），与ACmod呈显著正相关（rho = 0.47）。而在BC患者中，这些相关性均变弱、方向不一致且经FDR校正后不显著。组间相关系数的正式比较证实，DCmod和RMSSD的相关系数在健康对照与BC患者之间存在显著差异（Spearman校正z分别为-2.10和-2.03，p均小于0.05），提示在恶性状态下自主神经调节与循环DNA动态之间的生理偶联丧失。
**3.4 生存分析**：根据ROC曲线Youden指数确定细胞外DNA最佳截断值为12.9 ng/mL，ncDNA为3460 GE/mL；而mtDNA和DNase活性的ROC曲线判别性能差（AUC分别为0.535和0.522）。按截断值或中位数分层后，log-rank检验均未显示总生存期的显著差异。这一阴性结果提示在短期随访和事件数有限的情况下，这些循环标志物尚不能作为既定预后工具。
讨论部分指出，ncDNA与MIBC的更强关联可能反映其更贴近肿瘤细胞更新或组织破坏，而mtDNA未显示诊断价值可能与肿瘤类型和生物学背景有关。DNase活性虽未区分全部患者与对照，但在MIBC中较低，提示晚期疾病中细胞外DNA清除受损。健康个体中细胞外DNA与HRV的负相关符合神经免疫调节概念，而BC患者中该相关性的缺失可能提示肿瘤相关应激和慢性炎症破坏了胆碱能抗炎通路调控。研究的局限性包括样本量小（尤其MIBC仅11例）、横断面设计、未充分调整HRV的混杂因素（如药物、呼吸、共病）、以及使用单一参考基因等。未来需在大规模多中心前瞻性队列中验证，并结合患者来源类器官和表观遗传调节因子（如EZH2）等平台探索动态功能反应。
结论部分翻译如下：尽管存在诸多局限性——尤其是本队列适度的样本量和临床模型的探索性——这项初步研究提供了对BC中循环细胞外DNA部分、DNase活性、临床分期、生存率及自主神经调节的综合评估。研究结果支持细胞外DNA——尤其是ncDNA——作为疾病存在和生物学严重程度的微创指标的潜在价值，同时将DNase功能受损以及自主神经-炎症（HRV–细胞外DNA）偶联的丧失确立为系统性失调的引人注目的探索性通路。
