非传统酵母Pichia ethanolica适应性实验室进化改善糖蜜利用揭示多层次适应性重塑

《Microorganisms》：Adaptive Laboratory Evolution of the Non-Conventional Yeast Pichia ethanolica for Improved Molasses Utilization Reveals Multilevel Adaptive Remodeling

　　

糖蜜是一种丰富且低成本的发酵原料，但其直接利用常受其复杂组成和抑制成分的限制。在本研究中，研究人员从茶根际土壤中分离出一株可利用糖蜜的酵母菌株M0，并将其鉴定为Pichia ethanolica。M0可直接在仅用水稀释的未经处理的糖蜜中生长，并在逐步增加的糖蜜浓度下进行了适应性实验室进化(adaptive laboratory evolution, ALE)。经过70次传代后，进化后的种群OD560达到26.41，相较于亲本菌株提高了73.1%，并分离出一株优良菌株命名为M70。M70在100 g/L糖蜜培养基中培养48小时后显示出较低的蔗糖残留量(16.02 vs. 21.11 g/L)，并在高糖蜜、高温和高NaCl条件下表现出改善的生长，同时在特定乙醇和氧化胁迫条件下也具有额外的生长优势。基因组重测序鉴定了五个小型候选变异和一个染色体间重复插入，包括涉及RIB1、SOL3以及一个CET1样/REX2样区域的改变。转录组学和代谢组学分析鉴定了179个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)和169个差异积累代谢物(differentially accumulated metabolites, DAMs)。整合分析强调了D-氨基酸、精氨酸和脯氨酸、β-丙氨酸以及乙醛酸和二羧酸代谢中的协同变化。这些发现表明，在P. ethanolica中与改善的糖蜜适应性相关的多层次基因组、转录和代谢重塑。

研究背景与科学问题

糖蜜作为制糖工业的副产品，因其高蔗糖含量和丰富的营养成分，被广泛用作微生物发酵的经济底物。然而，粗糖蜜中含有重金属、色素和悬浮固体等多种抑制性组分，会抑制微生物生长并降低产物形成，从而增加预处理成本并限制整体工艺效率。此外，微生物高效同化糖蜜碳源并适应其复杂的高糖环境的能力也制约了糖蜜的利用。因此，提高微生物对糖蜜的利用率仍是工业发酵中的重要挑战。尽管通过代谢工程策略优化碳代谢、缓解碳分解代谢物阻遏以及增强细胞胁迫耐受性等方面已取得进展，但这些理性工程策略仍依赖于详细的遗传信息，且难以全面应对细胞调控网络的复杂性。同时，高效的糖蜜发酵需要微生物在维持有效碳源利用的同时，应对抑制剂、渗透压及其他环境胁迫，这些因素间的相互作用可能产生生理权衡，难以通过靶向工程单独解决。因此，亟需能够在全细胞水平改善复杂表型的非靶向方法，其中适应性实验室进化(adaptive laboratory evolution, ALE)已成为一种有前景的策略。本研究旨在探索ALE如何重塑非传统酵母Pichia ethanolica的代谢和调控网络以改善糖蜜利用，并揭示其分子机制。该论文发表于《Microorganisms》。

关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：从中国河南省信阳市茶根际土壤（约10厘米深度）采集样品，经富集培养和筛选获得目标菌株M0；基于部分18S rRNA基因和内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列进行分子鉴定及系统发育分析，并结合全基因组测序计算平均核苷酸一致性(average nucleotide identity, ANI)；在逐步递增的糖蜜浓度（初始80 g/L至最终200 g/L）条件下进行为期70次传代的适应性实验室进化；通过全基因组重测序鉴定单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)和结构变异(structural variations, SVs)；利用RNA测序(RNA-seq)进行转录组学分析；采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行非靶向胞内代谢组学分析；并使用高效液相色谱(HPLC)分析胞外代谢物。

研究结果

3.1 菌株M0的分离、鉴定与表征

研究人员从茶根际土壤中分离到一株能在未处理糖蜜中生长的酵母菌株M0。形态学观察显示其为典型的酵母形态，系统发育分析和全基因组ANI值（FastANI为98.9%，skani为99.2%）将其鉴定为Pichia ethanolica。Biolog YT微孔板碳源利用谱分析表明，M0能够利用多种糖类、糖醇和有机酸，其中α-D-葡萄糖利用水平最高，蔗糖呈中等利用水平，这支持了其适用于后续糖蜜培养和ALE实验。

3.2 适应性实验室进化与糖蜜适应菌株M70的筛选

在ALE过程中，研究人员以80 g/L糖蜜为起始浓度，每15次传代增加40 g/L直至200 g/L并维持至70次传代结束。进化过程中生长性能逐步提升，最终进化种群的OD₅₆₀达到26.41，较亲本菌株M0提高了73.1%。从进化种群中分离出的优良菌株M70在糖蜜培养基和YPD培养基中均表现出优于M0的生长，且该表型在连续十次传代后保持稳定。HPLC分析显示，在100 g/L糖蜜培养基中培养48小时后，M70的蔗糖残留量低于M0（16.02 vs. 21.11 g/L），而甘油（2.48 vs. 0.38 g/L）和乙醇（4.44 vs. 2.27 g/L）积累量更高。M70在96小时内的发酵动态监测显示，蔗糖、葡萄糖和果糖逐渐消耗并在96小时几乎耗尽，乙醇浓度持续上升至8.9 g/L，甘油则在24小时达到峰值3.2 g/L后下降。

3.3 菌株M70增强的胁迫耐受性与生长性能

在多种模拟糖蜜发酵胁迫条件的比较实验中，M70在所有测试温度（28-37°C）、糖蜜浓度（100-280 g/L）和NaCl浓度（1-5%）下均显著高于M0的OD₅₆₀值。在5%和10%乙醇条件下，M70的生长显著优于M0，但在15%乙醇条件下无显著差异。在1 mM和3 mM H₂O₂诱导的氧化胁迫下，M70表现出显著更高的OD₅₆₀，但在2 mM时无显著差异。此外，在以葡萄糖、果糖或蔗糖为唯一碳源的合成培养基中，M70的生长均显著优于M0。

3.4 全基因组重测序揭示与适应性进化相关的候选变异

以M0基因组为参考进行全基因组重测序，考虑到M0高度杂合的二倍体样基因组结构，研究人员优先筛选出在两次M70重测序数据中一致检出、具有预测功能效应并与亲本背景不同的变异。共保留六个候选变异：一个FLO11样基因的内含子突变；RIB1（GTP环化水解酶II）、SOL3（6-磷酸葡糖酸内酯酶）、一个ML样蛋白基因和一个ABC转运蛋白相关基因的非同义替换；以及一个长度为1.69 kb的染色体间重复插入，该插入破坏了CET1样基因（编码Cet1样mRNA三磷酸酶）的编码区，并形成了异常嵌合转录本，其插入片段来源于含有预测bZIP结构域的REX2样区域。RIB1和SOL3在M70中转录本丰度降低，REX2样基因也显示较低转录本丰度。

3.5 转录组学和代谢组学分析揭示M70长期适应相关的代谢改变

转录组学分析在M70相对于M0中共鉴定出179个差异表达基因(DEGs)，包括48个上调基因和131个下调基因。京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析显示，上调基因主要富集于β-丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及D-氨基酸代谢；下调基因则富集于丙酮酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢以及三羧酸循环(TCA cycle)等中心碳代谢通路。非靶向代谢组学分析鉴定出169个差异积累代谢物(DAMs)，包括44个增加和125个减少的代谢物。KEGG富集分析表明DAMs主要与氨基酸和中心碳代谢相关。整合分析确定了四个在转录和代谢物水平均发生变化的通路：D-氨基酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、β-丙氨酸代谢（以上调基因为主）以及乙醛酸和二羧酸代谢（以下调基因为主）。

总结与讨论

研究表明，M0菌株能够直接在仅用水稀释的未处理糖蜜中生长，证实P. ethanolica可在无需额外营养补充的条件下获取生长所需养分。ALE进一步改善了菌株的表型性能，M70在高糖蜜浓度下表现出增强的生长以及对乙醇、氧化、盐和温度胁迫的耐受性，且该表型在短期内保持稳定。M70在糖蜜培养中蔗糖残留降低、甘油和乙醇积累增加，甘油的瞬时积累可能与渗透适应有关。全基因组重测序鉴定出多个候选遗传变异，包括与核黄素/辅因子生物合成和戊糖磷酸途径相关的RIB1和SOL3替换，以及影响mRNA三磷酸酶的CET1样基因破坏性结构变异。这些变异应被视为候选适应性改变而非因果突变。转录组学和代谢组学分析揭示了广泛的氨基酸和中心碳代谢重塑，其中D-氨基酸、精氨酸和脯氨酸、β-丙氨酸代谢的改变可能与胁迫适应有关，而乙醛酸和二羧酸代谢的下调则与糖蜜富含糖分环境下替代碳同化途径依赖性的降低相一致。总体而言，表型、基因组、转录组和代谢组数据支持了一个多层次适应性重塑模型：适应性进化伴随着候选基因组变异以及涉及中心碳和氨基酸代谢、营养转运、膜相关过程和胁迫响应的协调转录和代谢变化，这些变化与P. ethanolica在糖蜜中改善的生长和发酵性能以及增强的多重环境胁迫耐受性相关联。该研究为非传统酵母适应的分子基础提供了见解，并为P. ethanolica在糖蜜基生物转化中的进一步发展奠定了基础。