《Microorganisms》：Deployment Readiness of Anammox for Wastewater Treatment with Potential Carbon-Saving Benefits: Environmental Risks, Monitoring Requirements and Implementation Pathways
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自然发酵酸笋是功能性乳酸菌（LAB）的潜在来源。本研究从酸笋中筛选LAB，并在体外评估其调节患者粪便微生物群的潜力。通过形态学和生理生化筛选共获得42株候选分离株。排除5株表现出中度抗生素耐药性的菌株后，对剩余37株分离株评估了胃肠耐受性、对肠道病原体的拮抗活
自然发酵酸笋是功能性乳酸菌（LAB）的潜在来源。本研究从酸笋中筛选LAB，并在体外评估其调节患者粪便微生物群的潜力。通过形态学和生理生化筛选共获得42株候选分离株。排除5株表现出中度抗生素耐药性的菌株后，对剩余37株分离株评估了胃肠耐受性、对肠道病原体的拮抗活性以及黏附相关特性。主成分分析（PCA）确定了9株菌株供进一步评估。将这些菌株分别引入由细菌性腹泻肠炎患者混合粪便样本制备的体外结肠发酵系统中。发酵48小时后，通过16S rRNA基因测序评估微生物群落组成，并定量短链脂肪酸（SCFA）。LAB处理与较高的厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度和较低的变形菌门（Proteobacteria）相对丰度相关。与混合粪便悬液（MFS）对照组相比，MRS-6、MRS-12、MRS-36和MRS-48组中埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia–Shigella）的相对丰度降至1%以下，同时健康相关的共生菌属如布劳特氏菌属（Blautia）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、粪杆菌属（Faecalibacterium）和拟杆菌属（Bacteroides）增加。MRS-36、MRS-46和MRS-6组的总SCFA浓度分别达到14.51、13.55和12.16 mmol/L，其中MRS-36和MRS-46组的丁酸盐浓度最高。这些发现建立了一个将体外功能表型与复杂粪便微生物群落验证相联系的序贯筛选框架，并鉴定出具有良好微生物群和SCFA调节潜力的候选菌株。
研究背景与目的
自然发酵食品是乳酸菌（LAB）等潜在益生微生物的重要来源。酸笋作为一种传统无盐发酵食品，在自然发酵过程中乳酸菌逐渐富集，使其成为功能性LAB的潜在资源库。然而，目前对源自酸笋的LAB研究多集中于分离、鉴定或单一体外性状，对其安全性、综合生理特性以及在复杂肠道微生物群落中的行为表征尚不充分。此外，基于单一参数的菌株选择可能无法充分反映其整体功能潜力。因此，研究人员开展此项研究，旨在建立一个整合初步安全筛选、多变量功能评估、主成分分析（PCA）优选及复杂微生物群落验证的序贯筛选策略，以系统评估酸笋源LAB的功能潜力。该论文发表于《Microorganisms》。
主要关键技术方法
研究人员采用以下关键技术方法：
- 1.
从中国广西柳州采集新鲜竹笋，经自然厌氧发酵制备酸笋样品，作为菌株分离来源。
- 2.
利用16S rRNA基因扩增与测序进行菌株分子鉴定。
- 3.
采用纸片扩散法进行初步表型抗生素敏感性筛查。
- 4.
运用改良牛津杯扩散法测定菌株对大肠杆菌（Escherichia coli）、痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的拮抗活性。
- 5.
通过模拟胃液和肠液处理评估菌株的胃肠道耐受性。
- 6.
测定菌株的自凝聚、共凝聚能力和细胞表面疏水性以评估黏附相关表型。
- 7.
应用主成分分析（PCA）进行综合性状评分与排序。
- 8.
利用来自5名细菌性腹泻肠炎患者的混合粪便样本构建体外结肠发酵系统，结合16S rRNA基因扩增子测序和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，分析微生物群落组成和短链脂肪酸（SCFA）浓度变化。
研究结果
3.1 候选菌株的分离与纯化
通过培养分离及初步生理生化筛选，从酸笋中共获得42株候选菌株，表明酸笋蕴含多样化的可培养LAB。
3.2 候选菌株的鉴定
16S rRNA基因序列分析显示，这些菌株主要归属于植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）、戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）、发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）、食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）、融合魏斯氏菌（Weissella confusa）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），显示出显著的分类多样性。
3.3 初步表型安全评估
所有42株候选菌株均表现为γ-溶血且无黏蛋白降解活性。根据预设的纸片扩散标准，5株菌因对一种或多种抗生素表现出中度敏感性而被排除，其余37株进入后续功能评估。
3.4 候选菌株的体外功能特性
所有37株菌对三种指示病原体均表现出拮抗活性，但抑制程度存在菌株特异性。在模拟胃液（pH 2.5）中暴露4小时后，存活率介于62.17%至79.85%。转入模拟肠液24小时后，多数菌株存活率显著下降，但MRS-6、MRS-12等9株菌存活率仍高于40%。黏附相关表型在不同菌株间表现不一，表明需整合多项指标进行评估。
3.5 基于PCA的综合筛选
对37株菌的8项体外功能变量进行PCA分析。KMO值为0.786，Bartlett球形检验显著。提取两个特征值>1的主成分（PC1和PC2），累计解释52.89%的方差。根据综合得分排名，得分>0.7的前9株菌（MRS-6、M17-24、MRS-12、MRS-34、MC-38、MRS-46、M17-22、MRS-27、MRS-36）被选入后续体外粪便发酵实验。
3.6 候选菌株对患者粪便样本体外发酵过程中微生物群的影响
- •
ASV概况：共有31个ASV被所有10个发酵组共享，各处理组也拥有数量不等的独有ASV，表明菌株补充影响了群落结构。
- •
α多样性：稀疏曲线接近饱和，Good's覆盖度在0.998-1.000之间。Chao1、观测ASV数、Shannon和Simpson指数在各组间无显著差异（q > 0.05）。
- •
β多样性：基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）显示，不同处理组的细菌群落组成存在显著差异（伪-F = 7.93, R2 = 0.704, p = 0.001），表明菌株处理对微生物群落结构产生菌株特异性影响。
- •
群落组成：在门水平，LAB处理与厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度升高和变形菌门（Proteobacteria）相对丰度降低相关。在属水平，与混合粪便悬液（MFS）对照相比，MRS-6、MRS-12、MRS-36和MRS-46组中埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia–Shigella）的相对丰度降至1%以下，而布劳特氏菌属（Blautia）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、柯林斯菌属（Collinsella）、粪杆菌属（Faecalibacterium）和拟杆菌属（Bacteroides）等共生菌属的相对丰度不同程度增加。Kruskal-Wallis检验证实，多个处理组的Escherichia–Shigella相对丰度显著低于MFS对照组（q < 0.05）。
3.7 候选LAB对患者粪便样本体外发酵过程中SCFA的影响
总SCFA浓度在处理组间差异显著。MRS-36、MRS-46和MRS-6组的总SCFA浓度最高，分别达14.51、13.55和12.16 mmol/L，主要由乙酸、丙酸和丁酸的积累驱动。特别是MRS-36和MRS-46组产生了最高的丁酸浓度（分别为3.25和2.77 mmol/L）。所有候选菌株组（除M17-22外）的丁酸浓度均显著高于MFS对照组（p < 0.05）。
讨论总结
本研究表明，源自酸笋的LAB在安全性、胃肠耐受性、病原体拮抗和黏附特性方面存在显著的菌株特异性。PCA多变量筛选有助于整合多项功能指标，减少单一性状选择的偏差。然而，PCA排名未能完全预测菌株在复杂粪便群落中的表现，强调了在复杂微生物群落中进行验证的必要性。体外发酵结果显示，特定LAB菌株能有效降低Escherichia–Shigella的相对丰度并提升有益代谢物SCFA（尤其是丁酸）的水平，这可能与微生物交叉互养有关。研究也指出了局限性，包括使用混合粪便样本无法评估供体特异性反应、V3-V4扩增子测序的分辨率限制以及体外系统缺乏宿主因素。未来需进行独立供体水平的发酵验证，并结合qPCR、全基因组测序、宏基因组学和代谢组学等方法深入研究。
研究结论翻译
本研究鉴定了一组源自酸笋的具有潜在功能价值的LAB，更重要的是，建立了一个整合初步安全排除、多变量功能评估、PCA选择和复杂微生物群落验证的序贯筛选策略。通过将菌株水平的表型筛选扩展到体外粪便微生物群落中的功能评估，该方法解决了仅凭单一耐酸、抗菌或黏附相关性状选择候选益生菌菌株的部分局限性。结果进一步表明，在常规体外试验中表现优良的特性并不一定能转化为在复杂微生物群落中的等效响应。因此，将多变量筛选与体外粪便发酵相结合，可能提高候选菌株优先排序的特异性。这些发现拓展了对传统发酵酸笋中LAB功能多样性的认识，并为后续的全基因组安全评估、代谢表征、机制研究以及开发面向微生物群的功能性制剂提供了菌株和方法学基础。
