《Microorganisms》：Construction and Comparison of Molecular Identification Methods for Mannheimia haemolytica
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溶血性曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）是引起牛和羊细菌性肺炎的主要病原体。目前已存在多个用于其鉴定的PCR靶标，但尚未有标准化的引物对得到广泛采用。本研究利用临床M. haemolytica分离株评估了六对已报道引物（包括rpt2）的通
溶血性曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）是引起牛和羊细菌性肺炎的主要病原体。目前已存在多个用于其鉴定的PCR靶标，但尚未有标准化的引物对得到广泛采用。本研究利用临床M. haemolytica分离株评估了六对已报道引物（包括rpt2）的通用性。针对常见反刍动物致病/共生菌标准株及其他曼海姆菌属（Mannheimia）物种进行了属内特异性检验。四对引物（gcp、artJ-lktC、lktD、sodA）无法将M. haemolytica与其他曼海姆菌属物种区分开。rpt2引物通用性欠佳，22株受试分离株中有3株扩增结果为阴性。rpoB引物具有良好的通用性和特异性，但其136 bp扩增产物不适用于与M. haemolytica血清分型引物共同构建多重PCR。研究人员发现了原始rpt2引物的设计缺陷，并开发了一种新型rpt2-N引物。评估证实该引物具有强通用性、特异性和灵敏度，且能与血清分型引物兼容用于多重PCR检测。在重庆地区三个山羊养殖场的现场检测显示，在气温骤降和运输后，M. haemolytica阳性率显著升高。血清型A2被确认为重庆地区山羊中的优势血清型。本研究系统评估了多个PCR鉴定引物，确认了rpoB的可行性，并解决了rpt2的通用性局限，为快速、准确地检测M. haemolytica提供了技术支持。
溶血性曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）分子鉴定方法的系统评估与新型rpt2-N引物的开发
**研究背景与问题**
溶血性曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）为巴氏杆菌科（Pasteurellaceae）曼海姆菌属（Mannheimia）中临床最常见的物种，主要定植于牛、山羊和绵羊等反刍动物的上呼吸道。在病原入侵或不良环境应激导致宿主免疫力下降时，该菌可在体内迅速增殖，是牛呼吸道疾病综合征和绵羊肺炎的主要病原，还与羔羊突然死亡相关的皱胃炎有关。目前，M. haemolytica的鉴定方法包括常规病原分离与生化试验、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和基于PCR的分子检测。前两种方法需要先进行单菌落分离，无法直接检测临床原始样本，而PCR可对纯培养菌液和组织样本进行快速筛查。然而，对于M. haemolytica的PCR鉴定，目前尚无标准化的分子靶标。已报道的靶基因包括artJ-lktC、rpt2、lktD、rpoB、gcp和sodA。其中，针对rpt2基因的引物使用最广泛，在已发表试验中表现出较高特异性，但有研究发现其无法识别某些田间分离株。此外，基于sodA的多重PCR方法虽可区分M. haemolytica与其他牛呼吸道细菌，但尚未在小型反刍动物上呼吸道定植的其他曼海姆菌物种中验证特异性。rpoB引物于2024年新设计，需进一步评估；artJ-lktC和gcp引物也未被系统评估。因此，本研究旨在系统比较六对已报道PCR引物对M. haemolytica的特异性和通用性，重点针对rpt2引物进行改进，并开发可同时鉴定物种和血清分型的多重PCR方法，为临床快速准确诊断提供技术支持。
**研究内容与结论**
研究人员首先利用22株保存的M. haemolytica临床分离株（包括16株山羊源和6株牛源，含血清型A1、A2和A6）评估六对已报道引物（gcp、rpoB、sodA、artJ-lktC、lktD、rpt2）的扩增效果，并用其他曼海姆菌属物种（如M. glucosida、M. granulomatis、M. ruminalis、M. varigena）及18株常见反刍动物呼吸道病原/共生菌验证特异性。结果显示，gcp、artJ-lktC、lktD和sodA引物均产生了与M. haemolytica阳性对照大小和亮度一致的非特异性条带，无法区分M. haemolytica与其他曼海姆菌；rpt2和rpoB引物则表现出良好的特异性。在通用性方面，rpt2引物仅能扩增22株中的19株，3株（Mh-21、Mh-23等）扩增阴性。对rpt2基因序列的系统发育分析将其分为两个基因型：多数分离株属于以39,433株为代表的基因型I，而Mh-21和Mh-23属于以NCTC 10,208为代表的基因型II。序列比对显示，rpt2基因存在两个保守区和两个可变区；传统rpt2引物结合在可变区上，其反向引物无法与基因型II模板退火，导致通用性不足。研究人员据此在保守区设计了两对候选引物（F1/R和F2/R），经特异性验证后，F2/R引物被命名为rpt2-N。rpt2-N能识别所有22株M. haemolytica，产生两种片段大小：基因型I为1067 bp，基因型II为911 bp；对其他曼海姆菌种和常见反刍动物细菌均无非特异性扩增，检测限达到40拷贝/μL。进一步将rpt2-N引物与Klima等建立的血清型（A1、A2、A6）鉴定引物组合，建立了多重PCR体系，可同时完成物种鉴定和血清分型。随后，利用rpt2-N引物对重庆地区3个集约化羊场和5个散养羊群共1836份鼻拭子样本进行流行病学调查，结果显示：集约化饲养山羊的M. haemolytica中位阳性率约为40%，显著高于散养山羊的10%（p<0.0001）；气温骤降使各集约化羊场阳性率显著升高至80%以上（p<0.0001）；长途运输后阳性率骤升至95.2%（80/84）。多重PCR鉴定出重庆地区山羊的优势血清型为A2。
**主要关键技术与方法**
本研究采用的主要技术方法包括：（1）基于PCR的分子鉴定方法，使用六对已报道引物进行物种特异性扩增；（2）全基因组测序数据中提取rpt2基因序列，结合NCBI BLAST检索和邻接法（NJ）构建系统发育树，进行基因分型；（3）基因序列比对分析保守区与可变区，设计新型引物rpt2-N；（4）将rpt2-N引物与血清型特异性引物组合构建多重PCR体系；（5）对重庆地区3个集约化羊场和5个散养羊群的1836份鼻拭子样本进行现场流行病学调查，样本分为适宜温度组（612份）、气温骤降组（608份）、长途运输前后配对样本（168对）及散养羊群样本（448份）。
**研究结果**
**3.1 通过PCR鉴定M. haemolytica田间分离株：** 利用测序确认的分离株评估六对引物，gcp、rpoB、sodA、artJ-lktC和lktD引物能扩增所有22株，而rpt2引物仅扩增19株，且不同菌株间扩增片段长度略有差异。
**3.2 确认引物对近缘细菌的特异性：** 以四种其他曼海姆菌和两株Bibersteinia trehalosi为模板，gcp、artJ-lktC、lktD和sodA引物产生了非特异性条带，而rpt2和rpoB引物无扩增，说明后两者对近缘物种具有很强的特异性。
**3.3 非靶标细菌的扩增效率与特异性确认：** 针对rpoB和rpt2引物，用10株牛源和羊源常见菌株进行验证，两者均无非特异性扩增；以M. haemolytica基因组为模板时，两者的检测限均为1×10?3 ng/μL。
**3.4 M. haemolytica rpt2基因的分子特征：** 系统发育分析将rpt2分为两个基因型，多数分离株为基因型I，少数为基因型II。序列比对发现两个保守区和两个可变区；传统rpt2引物结合可变区，反向引物无法匹配基因型II，导致通用性不足。新设计的rpt2-N引物靶向保守区A和B，并在正向引物中加入简并碱基以耐受株间碱基错配。
**3.5 PCR检测方法的性能：** 新设计的F2/R引物（命名为rpt2-N）能鉴定所有受试M. haemolytica分离株，产生1067 bp（基因型I）和911 bp（基因型II）两种片段；对其他曼海姆菌和常见细菌无非特异性扩增，检测限为40拷贝/μL。
**3.6 多重PCR：** 将rpt2-N引物与血清型特异性引物（针对hyp、core、tupA基因）组合成多重PCR体系，18株M. haemolytica分离株均扩增出rpt2-N和血清型A2标记Core2的特异性条带，验证了该体系的可靠性。
**3.7 临床检测：** 通过比较采样部位、DNA提取试剂盒和扩增酶，确定使用鼻拭子、天根试剂盒和Takara rTaq酶可获得满意检出率。大规模筛查显示，集约化饲养山羊阳性率（约40%）显著高于散养山羊（约10%），气温骤降使阳性率升至80%以上，长途运输后阳性率高达95.2%。多重PCR结果显示血清型A2为重庆山羊优势流行株。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，呼吸道疾病严重制约了全球牛羊养殖业的发展，M. haemolytica是其中关键病原之一。既往研究中M. haemolytica的分离率在不同地区可达21.8%至34.2%，因此建立统一标准的检测方法十分必要。本研究发现仅有rpt2和rpoB引物能有效区分M. haemolytica与其他曼海姆菌及B. trehalosi。rpoB引物扩增产物仅为136 bp，不适合与血清型引物构建多重PCR，故重点改进了rpt2基因引物。rpt2基因的基因型II存在156 bp缺失，导致rpt2-N引物产生两种片段大小，这反而有利于快速区分基因型。研究还讨论了现场采样策略的局限性，包括样本来自有限农场、非随机抽样、可能存在地理和养殖类型的偏倚，未来需扩大样本来源以更全面评估rpt2-N引物的通用性。尽管M. haemolytica是机会性病原体，但分子检测仍属必要；PCR阳性检出率可作为评估羊群健康状况的实用指标。研究初步观察到冷应激和运输应激显著提高阳性率，散养阳性率明显低于集约化饲养。多重PCR鉴定出A2为重庆地区山羊的优势血清型，为该病原的疫苗研发提供了基础数据。研究结论为：研究人员建立了一种基于rpt2基因的新型M. haemolytica PCR检测方法，解决了原有引物特异性不足导致的通用性问题，并确认了rpoB引物的可行性。
