利用mRNA脂质纳米颗粒靶向肿瘤相关巨噬细胞用于细胞毒性T淋巴细胞介导的癌症免疫治疗

《SCIENCE ADVANCES》：Targeting tumor-associated macrophages using mRNA lipid nanoparticles for cytotoxic T lymphocyte–mediated cancer immunotherapy

　　

摘要
免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）仍是限制免疫治疗响应性的主要障碍之一。近年来，携带信使RNA（messenger RNA, mRNA）的脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）已成为调节免疫抑制性TME的一种有前景的策略，其最终目标是维持细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）的抗癌免疫。然而，基于mRNA的细胞因子/趋化因子疗法仍面临诸多挑战，例如缺乏特异性靶向、治疗效力低以及毒性较高，这些均引发了对其临床转化的担忧。在本研究中，研究人员开发了一种抗体包被的脂质纳米颗粒（antibody-coated lipid nanoparticle, Ab-LNP）递送系统，该系统可靶向肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage, TAM）表面表达的髓样细胞触发受体2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2, TREM2）。研究人员证明，将Toll样受体激动剂和编码CXCL9的mRNA共同包封于Ab-LNP中递送，可成功改善免疫抑制，并提高CTL的肿瘤浸润和活性。进一步与针对PD-L1和CTLA-4的免疫检查点抑制剂联合使用，可促进有利于CTL的免疫学环境并产生持久的记忆免疫。该靶向TAM的Ab-LNP系统凸显了重编程免疫抑制性TME以增强CTL活性、从而改善癌症免疫治疗响应性的潜力。

**论文解读：靶向肿瘤相关巨噬细胞的mRNA脂质纳米颗粒增强CTL介导的癌症免疫治疗**

**一、研究背景与科学问题**

癌症免疫治疗，尤其是以细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL；即CD8⁺ T细胞）为核心的免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）和嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）T细胞疗法，已革新了癌症治疗格局。然而，实体瘤的治疗响应率仍受限于肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的免疫异质性。免疫抑制性TME不仅可诱导T细胞耗竭，还能阻碍CAR-T细胞的肿瘤浸润，从而严重削弱免疫治疗的临床获益。作为肿瘤中最丰富的免疫细胞群之一，肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage, TAM）通过分泌免疫抑制性细胞因子和趋化因子、表达抑制性免疫检查点以及抑制抗原呈递细胞（antigen-presenting cell, APC）和T细胞活性，在构建免疫抑制性TME中发挥核心作用，其存在常与患者预后不良相关。鉴于TAMs天然产生多种趋化因子，遗传改造TAM以增强趋化因子分泌，从而募集并激活CTL，成为一条极具前景但尚未充分探索的途径。脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）作为mRNA递送载体已获临床验证，但将功能性mRNA精准递送至TAMs并实现有效的免疫重编程，仍面临靶向特异性不足和递送效率低等挑战。

**二、研究内容与核心结论**

研究人员开发了一种此前未见报道的抗体包被LNP（antibody-coated LNP, Ab-LNP）递送系统，将Toll样受体7/8（Toll-like receptor 7/8, TLR7/8）激动剂雷西莫特（resiquimod）与编码趋化因子C-X-C基序配体9（C-X-C motif ligand 9, CXCL9）的mRNA共载，旨在抑制TAM免疫抑制功能并增强CTL肿瘤浸润。该系统通过在LNP表面包被靶向TAM表面标志物TREM2的单克隆抗体，实现了对TAM的特异性递送。体外和体内研究均证实，TREM2 Ab-LNP（T-RmRNA LNP）能显著提高TAM对LNP的摄取，同时降低对肿瘤细胞的脱靶递送，其TAM/肿瘤细胞摄取比达5.11，优于既往报道的靶向策略。共递送雷西莫特和CXCL9 mRNA可同时实现TAM免疫抑制表型的逆转（ARG1显著下调和NOS2显著上调）和CXCL9趋化因子的高效分泌。在4T1原位乳腺癌模型中，T-RmRNA LNP治疗显著抑制了肿瘤生长，降低了免疫抑制性TAM（CD206⁺CD86^?）的比例，并增加了肿瘤内CD8⁺ T细胞的浸润和活性。进一步与抗PD-L1和抗CTLA-4抗体联合治疗后，虽然在原发肿瘤体积上未观察到协同增效，但显著增加了肿瘤内CD4⁺FoxP3^?辅助T细胞和CD8⁺ CTL的数量，提高了CD8⁺ T细胞与调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）的比例，并在肿瘤引流淋巴结中诱导了显著的中枢记忆CD8⁺ T细胞应答，提示抗肿瘤记忆免疫的建立。组织病理学检查显示该治疗具有良好的耐受性和安全性。该研究为通过靶向并工程化改造免疫抑制性TAM来增强实体瘤CTL免疫治疗提供了一种新范式。

**三、主要关键技术方法**

1. **生物信息学分析**：利用TCGA数据库和LinkedOmics平台分析乳腺癌患者趋化因子表达与CD8A的相关性及预后价值，并运用基因集富集分析（GSEA）和免疫特征相关性分析。
2. **LNP制备与表征**：采用乙醇混合法制备mRNA/雷西莫特共载LNP，并通过硫醇-马来酰亚胺生物偶联反应进行TREM2抗体包被；利用动态光散射（DLS）、透射电镜（TEM）等表征理化性质。
3. **体外细胞实验**：分离并极化小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM），通过流式细胞术、共聚焦显微镜和ELISA评估LNP摄取、mRNA翻译效率、趋化因子分泌及巨噬细胞重编程。
4. **体内动物实验**：采用BALB/c小鼠原位4T1乳腺癌模型，通过活体生物发光和荧光成像评估LNP生物分布，并通过流式细胞术和ELISpot分析肿瘤免疫微环境及T细胞功能。样本来源于TCGA数据库及实验小鼠。

**四、研究结果分述**

1. **鉴定趋化因子CXCL9作为乳腺癌CTL的调节因子**：通过TCGA数据分析，发现CXCL9 mRNA水平与CD8A表达呈显著正相关，且高表达CXCL9的患者生存期更长。GSEA分析显示CXCL9表达与淋巴细胞免疫应答和适应性免疫功能正相关，且与CD8⁺ T细胞活性相关基因（如颗粒酶A、IFN-γ）表达相关。
2. **Ab-LNP递送系统的设计与表征**：优化TREM2抗体包被效率，在抗体与马来酰亚胺摩尔比1:1时达到91.6%的最高包被率。所得LNP粒径在80-100 nm范围内，均一性良好。
3. **Ab-LNP对免疫抑制性巨噬细胞的体外摄取特异性**：与未修饰LNP和甘露糖修饰LNP相比，T-mRNA LNP在免疫抑制性BMDM中表现出增强的摄取，而在4T1肿瘤细胞中的摄取降低，显示出更好的巨噬细胞靶向特异性。
4. **Ab-LNP在体内对TAM的靶向性**：在4T1荷瘤小鼠中，T-mRNA LNP在肿瘤内TAM中的DiD荧光强度显著高于对照组，且TAM/肿瘤细胞摄取比显著提升，免疫荧光共定位分析亦证实其被TAM有效摄取。
5. **雷西莫特共递送增强mRNA翻译效率**：共聚焦显微镜观察显示，雷西莫特与mRNA共包封于LNP中递送，在24小时时显著降低了LNP在溶酶体中的滞留并提高了GFP报告基因的表达，表明其可增强胞内mRNA翻译效率。
6. **LNP的体内抗癌治疗及免疫学效应**：T-RmRNA LNP治疗显著抑制4T1肿瘤生长，并增加肿瘤内CXCL9水平。该治疗显著降低肿瘤内ARG1表达和CD206⁺CD86^?免疫抑制性TAM比例，同时增加CD8⁺ T细胞浸润数量及CD44激活标志物表达。
7. **T-RmRNA LNP与免疫检查点抑制剂的联合治疗**：联合治疗显著增加了肿瘤内CD4⁺辅助T细胞和CD8⁺ CTL的绝对数量，并提高了CD8/Treg比例。同时，在肿瘤引流淋巴结中，联合治疗显著降低了初始CD8⁺ T细胞比例并增加了中枢记忆CD8⁺ T细胞比例，表明其可诱导抗肿瘤记忆免疫。

**五、讨论与结论**

研究人员开发了一种以TREM2为靶点的Ab-LNP系统，共递送TLR7/8激动剂和CXCL9 mRNA，能够特异性将免疫调节剂递送至TAMs。该策略在肿瘤微环境中同时实现了免疫抑制的解除和CTL趋化因子CXCL9的局部高表达，有效促进了CTL的浸润和激活。虽然联合ICB在原发肿瘤生长抑制上未显示出额外的协同效应，但免疫分析揭示了其创造了更有利于CTL的免疫微环境并建立了系统性的记忆免疫。作为一种静脉注射给药的靶向LNP平台，该系统在4T1模型中展示了良好的耐受性和安全性，支持了其进一步临床转化的潜力。

**研究结论**：本研究提供了一种此前未见报道的Ab-LNP系统，可特异性地将雷西莫特和mRNA-CXCL9递送至TAMs以缓解免疫抑制并表达CTL趋化因子，从而克服CTL免疫治疗的免疫屏障。该LNP系统在增强CTL肿瘤浸润和活性的同时实现了适度的治疗效果，并进一步增强了PD-L1和CTLA-4阻断疗法，创造了有利于CTL的免疫TME和抗肿瘤记忆免疫。该LNP系统的有效性和安全性支持了其在抗癌免疫治疗中的进一步研究和潜在的临床转化。