《SCIENCE ADVANCES》：The FAP × CD3 bispecific antibody OMTX305 induces T cell–mediated antitumor effects in patient-derived ex vivo models of solid tumors
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摘 要
在实体瘤中，基质屏障和免疫排斥限制了免疫治疗的成功。因此，需要新的治疗策略来重塑促肿瘤微环境并增强治疗反应。研究人员开发了一种双特异性、三价Fab-eIg T细胞衔接器（OMTX305），靶向成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activati
摘 要
在实体瘤中，基质屏障和免疫排斥限制了免疫治疗的成功。因此，需要新的治疗策略来重塑促肿瘤微环境并增强治疗反应。研究人员开发了一种双特异性、三价Fab-eIg T细胞衔接器（OMTX305），靶向成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein, FAP），该蛋白是促肿瘤癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）的标志物。OMTX305的转化潜力在二维（2D）和三维（3D）患者来源的临床前模型中进行了研究，重点关注与自体外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）共培养的肺癌和卵巢癌精准切取肿瘤切片（precision-cut tumor slices, PCTSs）。通过将空间生物学与细胞因子和转录组分析相结合，研究人员证明OMTX305治疗消除了表达FAP的成纤维细胞，诱导干扰素反应和细胞外基质重塑，最终触发邻近肿瘤细胞的旁观者杀伤效应。不同的免疫表型和PD-L1表达模式似乎与不同的治疗反应相关，提示其可作为患者分层生物标志物的潜力。这些发现凸显了靶向基质成分作为癌症治疗策略的临床潜力，并确立了PCTS作为个性化免疫治疗评估的强大临床前平台。
**论文解读：靶向肿瘤基质微环境的FAP × CD3双特异性抗体OMTX305的转化研究**
**一、 研究背景与科学问题**
实体瘤的肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）由多种细胞类型组成，其中癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）是重要的基质组成部分。CAFs并非被动的结构元件，它们通过分泌细胞因子、生长因子和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）蛋白，积极影响肿瘤的生长、侵袭和治疗抵抗，并与恶性细胞和免疫细胞相互作用，共同建立一个免疫抑制和促肿瘤生成的微环境。CAFs的异质性和可塑性进一步凸显了其在癌症进展中的多重作用。因此，靶向CAFs及其在TME中的相互作用，已成为一种旨在瓦解支持肿瘤发展的基质网络的新兴治疗策略。
成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein, FAP）在90%以上的癌组织中高表达，并与包括高级别浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer, HGSOC）和非小细胞肺癌（non–small cell lung cancer, NSCLC）在内的多种恶性肿瘤的不良预后相关。由于FAP主要表达于CAFs，靶向FAP成为重塑肿瘤基质、重建肿瘤免疫的有效方法。双特异性抗体，特别是T细胞衔接器（T cell engagers, TCEs），是一类有前景的免疫疗法。然而，TCEs在实体瘤中的临床成功仍然有限，主要障碍是实体瘤的免疫抑制性TME限制了T细胞的浸润和细胞毒性功能。因此，迫切需要开发能够调节TME并恢复T细胞功能的新型治疗策略。
**二、 研究内容与主要结论**
针对上述问题，研究人员开发了一种新型双特异性、三价抗原结合片段工程化免疫球蛋白（Fab-eIg）TCE，同时靶向FAP和CD3（命名为OMTX305），旨在调节TME并恢复T细胞功能。研究人员系统地评估了该策略，从二维（2D）培养的匹配患者来源CAFs和正常成纤维细胞（normal fibroblasts, NFs），到更复杂的三维（3D）CAF球体和异型CAF-肿瘤细胞球体，最终聚焦于源自卵巢癌和肺癌患者的精准切取肿瘤切片（precision-cut tumor slices, PCTSs）这一先进模型系统。研究结果表明，OMTX305治疗可激活T细胞，诱导FAP阳性基质区域的靶细胞死亡，并对邻近肿瘤细胞产生旁观者杀伤效应。
该研究发表在《科学进展》（SCIENCE ADVANCES）杂志上，其重要意义在于：证明了通过靶向基质成分来治疗癌症的临床潜力，并确立了PCTS作为一种强大的临床前平台，用于个性化免疫治疗评估和患者分层。
**三、 主要关键技术方法**
研究人员应用了多种关键技术方法。首先，利用已建立的eIg平台技术生成靶向FAP和CD3的双特异性TCEs，并通过SDS-PAGE和尺寸排阻色谱进行表征。其次，构建了包括2D共培养、3D球体和患者来源的PCTS等多种离体模型。PCTS样本来源于15例原发性人类肿瘤（5例NSCLC和10例HGSOC），并与自体PBMCs共培养。核心评估技术包括：基于ATP的活力测定、多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF）染色进行空间表型分析、基于流式细胞术的细胞因子谱分析，以及单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq）用于解析细胞亚群的转录组变化。此外，还应用了免疫组化（immunohistochemistry, IHC）和实时定量PCR（qPCR）等技术。患者自体PBMCs和肿瘤组织分别来自患者血液和手术切除标本。
**四、 主要研究结果**
**OMTX305通过T细胞接合在患者来源的CAFs中诱导FAP依赖性细胞毒性**
通过比较1+1和2+1化学计量比的TCEs，研究人员发现三价2+1 Fab-eIg分子（命名为OMTX305）显示出更强的T细胞接合活性，因此被用于后续研究。在2D共培养体系中，OMTX305处理以剂量依赖方式降低了FAP+ IKP-CAF-001的活力，且这种效应依赖于PBMCs的存在。FAP? A549和IKP-NF-001的活力不受影响，证实了靶点特异性。TCE介导的细胞毒性效率与每个CAF/NF对内FAP蛋白表达的相对差异密切相关。
**表达FAP的CAF球体在OMTX305作用下被T细胞浸润并杀伤**
在3D GFP标记的IKP-CAF-001球体模型中，OMTX305处理促进了CD3+ T细胞的浸润（T细胞密度从处理前的593 cells/mm2增加到处理后的1409 cells/mm2），并显著激活了浸润的T细胞（以颗粒酶B（granzyme B, GrB）表达为标志），诱导了CAFs的凋亡（以cleaved caspase-3, CC3为标志）。在缺乏FAP表达的H1437肿瘤细胞球体中，未观察到这些效应，证实了FAP依赖性。
**在异型球体中，OMTX305诱导CAFs和肿瘤细胞死亡**
在由FAP+成纤维细胞（核心）和FAP?肿瘤细胞（边缘）组成的异型球体中，OMTX305治疗不仅增强了成纤维细胞核心内的T细胞积累和激活，还显著增加了邻近肿瘤细胞的凋亡，表明存在旁观者抗肿瘤效应。
**OMTX305激活PCTS中的组织驻留T细胞**
在患者来源的PCTS模型中，OMTX305处理显著降低了CD3+ T细胞密度，但显著增加了FAP+基质区域内GrB+ T细胞的比例，并诱导了培养上清中GrB、穿孔素（Perforin）、颗粒溶素（Granulysin）、干扰素-γ（IFN-γ）和Fas配体（FasL）等细胞溶解和免疫刺激介质的产生。即使在没有外源PBMCs共培养的情况下，也观察到T细胞激活，表明OMTX305可以激活肿瘤组织中预先存在的组织驻留T细胞。
**在PCTS中，表达FAP的成纤维细胞和邻近肿瘤细胞被诱导死亡**
OMTX305治疗显著降低了PCTS的ATP水平（降至对照的69.6%），并减少了FAP+区域的比例。mIF分析显示，凋亡（CC3+）主要发生在FAP+区域的αSMA+成纤维细胞中。距离分析发现，凋亡的肿瘤细胞（CC3+ pan-CK+）比非凋亡的肿瘤细胞（CC3? pan-CK+）更靠近FAP+区域，平均距离为10至100 μm，为旁观者杀伤效应提供了空间证据。不同患者来源的PCTS对OMTX305的反应存在差异，治疗反应与T细胞激活水平（GrB水平）显著相关。
**免疫表型和免疫耗竭对OMTX305反应的潜在影响**
根据肿瘤组织中CD3+ T细胞的分布，研究人员将HGSOC患者样本分为免疫荒漠型（immune-desert）、免疫排斥型（immune-excluded）和免疫炎症型（immune-inflamed）。结果显示，免疫炎症型肿瘤通常表现出最强的T细胞激活和凋亡诱导。免疫排斥型肿瘤也显示出细胞死亡诱导，提示这类对免疫检查点阻断（ICB）反应不佳的患者亚群可能从OMTX305治疗中获益。免疫荒漠型肿瘤（仅1例）对治疗无反应。在NSCLC队列中，所有样本均为免疫炎症型，但PD-L1高表达的患者对治疗无反应，而PD-L1阴性患者表现出最强的凋亡反应，提示PD-L1表达状态可能影响治疗反应。
**OMTX305驱动T细胞激活并调节HGSOC免疫表型中特定亚群的基因表达**
单细胞RNA-seq分析确定了三个T细胞亚群：CD4+调节性T细胞（clusters 0）、效应性CD8+ T细胞（cluster 1）和高度增殖的T细胞群体（cluster 2）。OMTX305处理在CD4+ T细胞中诱导了协调的激活程序，包括上调Th1相关细胞因子（IFNG、TNF）和共刺激受体（ICOS、TNFRSF4、TNFRSF9），并伴随免疫检查点（CTLA4、ENTPD1、NR4A1）的诱导。在CD8+ T细胞中，OMTX305促进了向细胞毒性效应表型的分化，表现为IFNG、PRF1、GZMB等表达增强，同时上调抑制性受体（TIGIT、LAG3），但下调末端耗竭标志物TOX，提示可能保留了效应潜能。
**OMTX305在CAFs中诱导ECM重塑和干扰素反应**
对基质细胞的单细胞RNA-seq分析确定了五个不同的CAF亚群，包括一个FAP高表达肌成纤维细胞簇（cluster 0）、一个炎症性和代谢活跃的IL-6高表达CAF簇（cluster 1）、一个干扰素反应簇（cluster 2）、一个热休克蛋白高表达簇（cluster 3）和一个周细胞簇（cluster 4）。OMTX305处理降低了基质细胞总数，尤其在FAP高表达亚群中。在肌成纤维细胞簇中，处理导致胶原蛋白基因（COL1A1, COL1A2, COL6A3, COL11A1）表达下调，基质金属蛋白酶（MMP1, MMP3, MMP11）表达上调。此外，在不同CAF亚群中，干扰素反应基因（IRF1, IRF7, RSAD2, CXCL9）和应激反应基因（ATF3, PMAIP1）被诱导，同时涉及抗原呈递的基因（TAPBP, TAP1, TAP2）也上调。
**五、 总结与讨论**
讨论部分指出，FAP在不同肿瘤类型中的广泛表达使其成为调节免疫抑制性肿瘤基质、激活TME内T细胞的有前景的治疗靶点。本研究表明OMTX305在多种患者来源的实体瘤模型中，对FAP+ CAFs具有显著的细胞毒性作用，能够调节T细胞活性并影响肿瘤细胞活力。研究观察到TCE靶向FAP+肿瘤基质后，可通过Fas-FasL信号和可溶性促炎因子（如IFN-γ）介导旁观者杀伤效应，诱导邻近FAP?肿瘤细胞凋亡，这与以往CAR-T和双特异性抗体研究报道的机制一致。在PCTS中，OMTX305抗FAP单链可变区序列缺乏对健康组织的特异性结合，提示其脱靶毒性风险较低。
研究结论部分强调，研究结果支持OMTX305的持续临床开发，并建议考虑联合治疗策略，无论是与免疫检查点抑制剂（ICB）联合以靶向免疫耗竭，还是与T细胞刺激分子联合以扩增可用的肿瘤相关T细胞库。此外，鉴于免疫排斥型HGSOC患者对OMTX305治疗表现出反应，而这类患者通常对ICB治疗无应答，OMTX305可能为此类难治性患者提供新的治疗选择。该研究也指出了PCTS模型的局限性，例如培养期有限，无法研究长期的ECM组成变化，未来需要在更大的患者队列中验证其指导患者筛选的潜力。
