用于抑制肠杆菌生长和侵袭性的肠道代谢物双筛选揭示抗感染吲哚类分子的结构-活性关系

《Gut Microbes》：Dual screen for gut metabolites suppressing enterobacterial growth and invasiveness reveals structure–activity relationships among anti-infective indoles

　　

抗生素耐药危机使得表征新型抗感染分子成为紧迫课题。能够抑制细菌生长与存活、毒力或兼具上述特征的分子均值得深入探索。人肠道等天然存在的微生物-宿主生态系统，是为此类研究尚未充分开发的资源。研究人员开发了一个灵活平台，可并行评估肠道代谢物对致病菌沙门菌（Salmonella enterica）Typhimurium与福氏志贺菌（Shigella flexneri）生长及上皮细胞侵袭能力的影响。通过对肠道代谢物库筛选，该测定识别出多类抗感染化合物，并扩展了已有抗菌活性的报道，例如中链脂肪酸、胆汁酸、嘌呤核苷酸与吲哚。重要的是，靶向后续筛选结合化学生物学迭代表明，吲哚的抗感染活性如何受其衍生化影响。具体而言，吲哚骨架任意碳位甲基化可增强其对Ⅲ型分泌系统（Type-3-Secretion-System，T3SS）毒力蛋白表达、鞭毛运动性（沙门菌）及肠杆菌生长的浓度依赖性抑制；而N1-甲基化则显著削弱吲哚及其C-位甲基化衍生物的活性。该研究提供了用于侵袭性肠杆菌在候选抗感染分子暴露下生长与毒力双分析的测定方法，并阐明了吲哚代谢物的结构-活性关系。

研究背景方面，病原细菌借助毒力因子定植宿主组织，造成组织破坏、炎症及潜在致死性全身扩散。抗生素仍是细菌感染标准疗法，但抗菌耐药机制扩散威胁现有治疗选择。在寻找可选择性抑制或解除病原体武装且尽量少改变微生物-宿主生态系统的新化学剂时，天然代谢物是有吸引力的起点。哺乳动物肠道及其代谢组因微生物与化学复杂性，成为特别相关的资源。侵袭性肠杆菌如沙门菌Typhimurium（S. Tm）与福氏志贺菌（S. fl）通过Ⅲ型分泌系统（T3SS）及物种和菌株特异性辅助毒力因子侵袭肠上皮细胞（IECs）。常驻肠道菌群通过竞争空间营养、刺激宿主防御及产生微生物战争分子提供定植抵抗；菌群或宿主生成的肠道代谢物可调节细菌毒力。短链脂肪酸、中链脂肪酸（MCFAs）、长链脂肪酸（LCFAs）、胆汁酸、色氨酸衍生代谢物吲哚均被关联于肠杆菌毒力或生长抑制。嘌呤类如腺嘌呤、腺苷及其衍生物也有生长抑制报道。但肠道代谢组大部分及主要代谢物类的衍生物仍待功能挖掘。该研究发表于《Gut Microbes》。

主要关键技术方法方面，研究人员使用人空肠类器官来源IECs及Caco-2细胞建立96孔感染模型；以人肠道代谢物库（481种粪便代谢物）进行初筛；以40种吲哚衍生物进行亚筛并合成N1-甲基化二甲基吲哚；用携带胞内GFP报告质粒的S. Tm（p_ssaG-GFPmut2）与S. fl（p_uhpT-GFP）量化侵袭；通过定量RT-PCR测毒力与鞭毛基因，非靶向质谱蛋白质组学测全局蛋白，微分干涉差（DIC）活细胞成像追踪单菌游动速度；样本上采用人空肠组织术后建立的人源类器官Hu18-9jej及Caco-2细胞系。

研究结果部分保留小标题如下。An assay system to quantify enterobacterial growth and IEC invasion following gut metabolite exposure中，研究人员构建96孔格式测定，用S. Tm报告株感染Caco-2或人源类器官IEC单层，以相对OD₆₀₀与相对侵袭比归一化。ΔinvG（T3SS-1缺陷）与ΔmotA（无鞭毛运动）菌株相对侵袭剧降而生长正常，验证平台可分辨毒力与生长；91次模拟感染聚类于均值附近，表明噪声低；已知短链脂肪酸、CCCP、庆大霉素处理可被复现，证明平台稳健。S. fl改用p_uhpT-GFP并加离心步骤，同样分辨ΔmxiD与野生株。

Screening of a gut metabolite library for anti-infective activities中，以10 mM预处理S. Tm，481代谢物中30.8%为hit；98个抑侵袭不抑生长，50个同时抑生长与侵袭，无仅抑生长者。再发现中链脂肪酸、胆汁酸、维生素B6、嘌呤核苷酸及10种吲哚衍生物；3-甲基吲哚比吲哚更强抑侵袭。

A sub-screen of indoles provides structure–function insights and identifies a methylation position as a key anti-virulence determinant中，40种吲哚衍生物剂量反应得IC₅₀；吲哚绝对IC₅₀为681.4 μM，3-、6-、7-甲基吲哚降至113.2、178.2、97.6 μM；2-、5-甲基也增强。1-甲基吲哚无可靠IC₅₀。合成1,3-、1,6-、1,7-二甲基吲哚后，N1-甲基化抵消C-甲基化增效。低浓度抑侵袭、高浓度抑生长，且遗传或接种密度校正后毒力抑制仍存。

Methylation impacts indole derivative suppression of Salmonella virulence protein expression, motility, and enterobacterial invasivity中，qRT-PCR显示3/6/7-甲基吲哚比吲哚更强下调invG、sipA、fliC、fljB；蛋白质组学见T3SS-1蛋白在0.25 mM被选择下调，鞭毛蛋白在1 mM下调。DIC显示1 mM下甲基吲哚降低中位游动速度甚于吲哚，1-甲基吲哚无增效。S. fl对吲哚类总体较不敏感，但3/6/7-甲基吲哚在1 mM仍抑侵袭与生长，1-甲基化无效；T3SS缺失或密度校正可解耦生长与侵袭抑制。

讨论部分总结：传统微稀释与纸片扩散不能检测抗毒力活性，该成像平台可并行定量生长与IEC侵袭这一革兰阴性肠杆菌核心毒力性状。481代谢物筛再确认中链/长链脂肪酸、胆汁酸、维生素B6、嘌呤核苷酸与吲哚类。40种吲哚衍生物筛表明侧基组成与位置强烈影响抗生长与抗毒力；C2/3/5/6/7-甲基增强S. Tm与S. fl抗菌活性，N1-甲基大幅减弱且使二甲基衍生物失活。吲哚可作质子载体消散质子动力势（PMF），C-甲基提高亲脂性（logP升高）从而增膜扰动与能量利用干扰；N1-甲基破坏NH基团使质子载体功能受损。低浓度下仍抑T3SS-1转录与蛋白，提示还存在作用于毒力基因调控与运动调节的通路，涉及PhoPQ、CpxAR等应激模块待研。

结论部分翻译：该研究提供了一个灵活平台，用于解剖靶向肠杆菌的代谢物与合成化合物的抗生长 versus 抗毒力活动。此外，工作提供了基础性的结构-活性见解，将促进吲哚衍生物作为研究工具或未来抗感染开发支架的推进。