《Bioengineering》：Olopatadine Exerts Multifaceted Protective Effects in an Ovalbumin-Induced Allergic Eye Disease Mouse Model
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过敏性眼病（AED），包括过敏性结膜炎，是一种常见的免疫介导的眼表疾病，以瘙痒、发红、流泪和眼部不适为特征。尽管奥洛他定（OLO）被广泛用作抗组胺药和肥大细胞稳定剂，但其在AED中对免疫介导的炎症、神经肽相关反应以及上皮-黏膜改变方面的更广泛作用仍未完全阐明。
过敏性眼病（AED），包括过敏性结膜炎，是一种常见的免疫介导的眼表疾病，以瘙痒、发红、流泪和眼部不适为特征。尽管奥洛他定（OLO）被广泛用作抗组胺药和肥大细胞稳定剂，但其在AED中对免疫介导的炎症、神经肽相关反应以及上皮-黏膜改变方面的更广泛作用仍未完全阐明。本研究在卵清蛋白（OVA）诱导的AED小鼠模型中探讨了OLO的多方面作用。通过OVA致敏和局部激发在BALB/c小鼠中诱导AED，并在激发期间给予OLO治疗。评估了临床严重程度、抓挠行为、血清IgE、炎性细胞浸润（PMNs）、肥大细胞脱颗粒、细胞因子表达（IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α和IL-1β）、巨噬细胞浸润（F4/80）、iNOS表达、TRPV1、SP和CGRP表达、ZO-1表达、杯状细胞密度、黏蛋白表达（MUC5AC）、失调的细胞增殖（Ki67）以及凋亡细胞死亡（TUNEL）。OVA激发诱导了显著的过敏反应，包括临床评分升高、抓挠行为增加、血清IgE升高、肥大细胞脱颗粒、炎性细胞浸润以及Th2型和促炎细胞因子的上调。此外，OLO降低了TRPV1、SP和CGRP的表达，保留了ZO-1表达和杯状细胞密度，并减少了过度的上皮细胞增殖。值得注意的是，OLO在AED中表现出多方面的保护作用，为其在实验性AED中的作用提供了临床前见解，同时承认其在人类中已确立的临床应用。
一、研究背景与意义
过敏性眼病（AED）是眼表最常见的免疫介导性疾病之一，包括季节性和常年性过敏性结膜炎等多种类型，以眼痒、发红、流泪和肿胀为主要临床表现，给患者和全球医疗系统带来沉重负担。传统观点认为AED多为轻度和自限性，但越来越多的证据表明，若控制不当，AED可发展为慢性甚至致残性疾病，症状持续存在并严重影响患者日常生活。
AED的发病机制主要由免疫球蛋白E（IgE）介导的过敏反应驱动。在致敏阶段，抗原提呈细胞激活2型辅助性T细胞（Th2），后者分泌白细胞介素-4（IL-4）、IL-5和IL-13等细胞因子，促进B细胞向IgE类别转换并致敏肥大细胞。当再次接触过敏原时，肥大细胞表面高亲和力IgE受体（FcεRI）发生交联，触发快速脱颗粒并释放组胺等促炎介质，表现为结膜充血、水肿、流泪和瘙痒等早期相反应。肥大细胞激活还启动下游信号级联，招募多形核白细胞（PMNs）等炎性细胞，参与晚期相反应，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）等细胞因子进一步加剧过敏性炎症和血管通透性。
除免疫激活外，结膜上皮屏障等结构成分通过调节过敏原穿透和局部炎症反应影响疾病进展。炎症介质还可与感觉神经末梢相互作用，参与瘙痒和眼部不适的产生，提示炎症与感觉神经反应之间存在交互作用。
尽管已有多种治疗选择，包括抗组胺药、肥大细胞稳定剂和抗炎药物，但AED管理仍存在显著未满足需求。多数现有治疗主要靶向早期相组胺介导的反应，对慢性或重症病例仅能提供部分缓解，往往不能充分控制晚期相炎症，无法完全解决眼部不适，对上皮破坏等潜在组织改变影响有限。这些局限性凸显了对更全面治疗策略的需求。
奥洛他定（OLO）是一种兼具抗组胺和肥大细胞稳定作用的双重活性药物，广泛用于AED治疗。其通过抑制组胺受体激活和防止肥大细胞脱颗粒，有效减轻早期过敏反应的关键特征。此外，OLO还被认为具有更广泛的抗炎作用，可能影响细胞因子产生和细胞浸润。然而，OLO是否影响AED中的神经肽相关反应和结膜上皮-黏膜改变仍未完全阐明。本研究旨在单一卵清蛋白（OVA）诱导的小鼠模型中，综合评估OLO对AED多种疾病相关特征的保护作用，包括炎症反应、神经肽相关标志物表达和上皮-黏膜改变。
二、主要技术方法
研究人员使用21只8周龄雌性BALB/c小鼠（来源：Orient Bio Inc.，韩国城南市），在第0天通过腹腔注射OVA（10 μg）、氢氧化铝佐剂（1 mg）和百日咳毒素（300 ng）进行致敏，14天后随机分为正常组、OVA组和OVA+OLO治疗组三组。第15至21天，OVA组和OVA+OLO组小鼠每日两次接受局部OVA激发（200 μg/5 μL），OVA+OLO组额外接受0.1% OLO局部治疗。第22天处死动物并收集左眼进行分析。研究采用裂隙灯显微镜评估临床评分，行为学记录抓挠次数，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清OVA特异性IgE水平，苏木精-伊红（H&E）染色评估PMN浸润和血管扩张，甲苯胺蓝染色评估肥大细胞脱颗粒，免疫荧光染色检测TRPV1、SP、CGRP、F4/80、iNOS、IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-5、MUC5AC、ZO-1和Ki67表达，高碘酸-雪夫（PAS）染色评估杯状细胞密度，TUNEL染色检测细胞凋亡。
三、研究结果
3.1 OLO减轻OVA诱导AED小鼠模型的临床过敏症状。 通过裂隙灯显微镜观察发现，OVA组小鼠表现出明显的结膜充血、水肿、眼睑肿胀和黏液性分泌物增加，而OVA+OLO组较OVA组显著减轻了眼部发红、肿胀和分泌物。
3.2 OLO减少过敏原诱导的眼周抓挠行为。 行为学记录显示，OVA组小鼠眼周抓挠频率较正常组显著增加，而OVA+OLO组较OVA组显著减少，表明OLO减轻了过敏原诱导的眼部不适相关行为反应。
3.3 OLO抑制血清IgE水平。 ELISA检测显示，OVA组血清OVA特异性IgE水平较正常组显著升高，而OVA+OLO组较OVA组显著降低，表明OLO治疗减弱了过敏反应。
3.4 OLO抑制结膜肥大细胞脱颗粒。 甲苯胺蓝染色显示，OVA组结膜中肥大细胞脱颗粒显著增加，而OVA+OLO组较OVA组显著减少。
3.5 OLO减轻结膜血管扩张和PMN细胞浸润。 H&E染色显示，OVA组结膜出现明显血管扩张（血管扩张症）和大量PMN细胞浸润，而OVA+OLO组较OVA组显著减轻。
3.6 OLO降低结膜神经肽相关标志物免疫反应性。 免疫荧光染色显示，OVA组结膜中SP、TRPV1和CGRP免疫反应性较正常组显著增加，而OVA+OLO组较OVA组显著降低。
3.7 OLO减轻结膜巨噬细胞浸润和iNOS免疫反应性。 免疫荧光染色显示，OVA组F4/80阳性细胞和iNOS阳性细胞显著增加，而OVA+OLO组较OVA组显著减少。
3.8 OLO降低结膜促炎细胞因子免疫反应性。 免疫荧光染色显示，OVA组IL-6、TNF-α和IL-1β免疫反应性显著增加，而OVA+OLO组较OVA组显著降低。
3.9 OLO降低结膜Th2相关细胞因子免疫反应性。 免疫荧光染色显示，OVA组IL-4和IL-5免疫反应性较正常组显著增加，而OVA+OLO组较OVA组显著降低。
3.10 OLO保留杯状细胞密度。 PAS染色显示，OVA组杯状细胞密度较正常组显著降低，而OVA+OLO组杯状细胞密度较OVA组显著升高。
3.11 OLO增加结膜MUC5AC表达。 免疫荧光染色显示，OVA组MUC5AC表达显著降低，而OVA+OLO组较OVA组显著升高。
3.12 OLO保留ZO-1表达。 免疫荧光染色显示，OVA组ZO-1表达较正常组显著降低，而OVA+OLO组较OVA组显著升高。
3.13 OLO减轻结膜细胞凋亡。 TUNEL染色显示，OVA组TUNEL阳性细胞较正常组显著增加，而OVA+OLO组较OVA组显著减少。
3.14 OLO减少结膜细胞增殖。 Ki67免疫染色显示，OVA组结膜上皮Ki67阳性细胞显著增加，而OVA+OLO组较OVA组显著减少。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本研究在单一OVA诱导的AED小鼠模型中同时考察了OLO对免疫炎症反应、神经肽相关标志物表达和上皮-黏膜改变的影响。研究发现OLO不仅缓解经典过敏炎症反应，还降低神经肽相关标志物表达并保留ZO-1表达和杯状细胞群。OVA激发引起的神经肽相关标志物（TRPV1、SP、CGRP）上调在OLO治疗后显著降低，提示OLO可能调节过敏性眼部炎症中的感觉神经相关反应。上皮屏障方面，OLO治疗保留了ZO-1表达并减少Ki67和TUNEL阳性细胞，提示OLO可能调节OVA相关的上皮改变。杯状细胞方面，OLO治疗保留了杯状细胞群并增加MUC5AC表达，与临床研究中OLO增加过敏性结膜炎患者杯状细胞密度和改善眼表参数的结果一致。研究也承认了多项局限性，包括OVA模型代表急性过敏反应、OLO在激发期间而非疾病建立后给药、仅评估单一剂量和短期治疗、缺乏载体对照和直接比较药物等。
研究结论为：OLO在OVA诱导的AED小鼠模型中对眼表发挥多方面保护作用。OLO治疗与减轻炎症反应、降低神经肽相关标志物表达以及改变结膜上皮-黏膜特征相关。这些发现表明OLO在OVA诱导的过敏性炎症期间提供保护作用，支持其在该实验性AED模型中的潜在益处。该论文发表于《Bioengineering》期刊。
