《Biology》：Estrogen Suppresses Osteoclast Function and Cytoskeletal Remodeling via Modulation of the RhoA-Pkn3-c-Src Signaling Pathway in Ovariectomized Rats
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绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis, PMOP）的特征是破骨细胞活性增加导致的过度骨吸收。雌激素仍是预防骨丢失的有效治疗选择，但其对破骨细胞细胞骨架重塑的调节作用尚未完全阐明。本研究采用去卵巢（ovariectomized
绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis, PMOP）的特征是破骨细胞活性增加导致的过度骨吸收。雌激素仍是预防骨丢失的有效治疗选择，但其对破骨细胞细胞骨架重塑的调节作用尚未完全阐明。本研究采用去卵巢（ovariectomized, OVX）大鼠模型和RANKL诱导的RAW264.7破骨细胞，探讨RhoA-Pkn3-c-Src信号通路在雌激素抗骨吸收效应中的作用。采用显微计算机断层扫描（micro-computed tomography, micro-CT）评价骨微结构，通过组织学染色和免疫荧光评估破骨细胞活性和通路相关蛋白。体外实验分析了破骨细胞分化、骨吸收、肌动蛋白环形成和蛋白质相互作用，并使用RhoA激动剂进行额外验证。雌激素处理显著减轻OVX诱导的骨丢失，减少破骨细胞数量和活性，并改善骨小梁微结构。这些变化伴随破骨细胞中RhoA、Pkn3、c-Src和Pyk2表达降低。与此一致，雌激素在体外抑制RANKL诱导的破骨细胞分化、骨吸收和细胞骨架重塑，而RhoA激活可部分减弱这些效应。总之，这些发现提示雌激素对破骨细胞介导骨吸收的保护作用与RhoA-Pkn3-c-Src信号通路的调控相关，为PMOP的潜在机制提供了额外见解。
绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis, PMOP）是一种严重影响老年女性健康的代谢性骨病，由绝经后雌激素缺乏引起，以进行性骨量丢失、骨微结构破坏和脆性骨折风险增加为主要特征。临床上常用双能X线吸收法（DXA）检测骨矿盐密度（BMD）进行诊断，治疗包括生活方式干预、钙和维生素D补充以及双膦酸盐、地诺单抗、合成代谢药物和绝经期激素治疗等。雌激素替代虽能有效抑制破骨细胞过度活化、维持骨量并降低骨折风险，但因静脉血栓栓塞、卒中和激素依赖性恶性肿瘤风险增加，应用受限。因此，阐明雌激素调控破骨细胞的分子机制，对开发兼顾疗效与安全性的治疗策略具有重要意义。
破骨细胞是主要的骨吸收细胞，其高效吸收功能高度依赖细胞骨架重塑、肌动蛋白环形成、封闭区与皱褶缘的建立。小GTP酶RhoA是调节破骨细胞细胞骨架动态的关键分子；蛋白激酶N3（Pkn3）位于RhoA下游，能促进非受体酪氨酸激酶c-Src与富含脯氨酸酪氨酸激酶2（Pyk2）结合，参与封闭区组装。本研究利用去卵巢（OVX）大鼠和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导的RAW264.7破骨细胞模型，系统研究了RhoA-Pkn3-c-Src信号通路在雌激素抗骨吸收中的作用。研究结果显示，雌激素可显著减轻OVX诱导的骨丢失，抑制破骨细胞形成、骨吸收和细胞骨架重塑，并下调RhoA、Pkn3、c-Src和Pyk2的表达；RhoA激动剂可部分逆转雌激素的抑制作用。该研究发表于《Biology》，为PMOP机制理解和新型治疗靶点探索提供了依据。
在关键技术方法上，研究人员以3月龄雌性Sprague-Dawley大鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）建立OVX模型，并以中国医学科学院来源的RAW264.7细胞经RANKL诱导为破骨细胞；采用显微计算机断层扫描（micro-CT）、不脱钙骨切片甲苯胺蓝染色、免疫组织化学、ELISA、透射电镜、免疫荧光双标、TRAP染色、骨片吸收陷窝染色、F-actin环染色、实时荧光定量PCR、Western blot和免疫共沉淀（Co-IP）等方法，结合RhoA激动剂narciclasine和雌激素受体α（ERα）拮抗剂MPP进行干预验证。
研究结果如下。
3.1 雌激素减轻OVX大鼠骨密度丢失并改善骨微结构
通过监测体重发现OVX组大鼠体重随时间显著增加，雌激素干预12周后体重接近假手术组。显微CT显示雌激素使骨组织形态更完整，骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和连接密度（Conn.D）升高，结构模型指数（SMI）和骨小梁分离度（Tb.Sp）降低。不脱钙骨切片甲苯胺蓝染色显示雌激素显著增加骨小梁体积百分比，并更明显地抑制骨吸收表面百分比，提示OVX诱导的是高转换型骨质疏松，雌激素主要抑制骨吸收。
3.2 雌激素减少OVX大鼠破骨细胞形成及皱褶缘
免疫组织化学显示OVX组胫骨中破骨细胞标志物抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和活化T细胞核因子c1（NFATc1）表达显著升高，雌激素处理后明显下降。血清TRAP5b和I型胶原交联C端肽（CTX-I）水平在雌激素组也显著降低。透射电镜观察发现OVX组破骨细胞具有清晰附着于骨表面的皱褶缘，雌激素干预可部分逆转这一结构，表明雌激素能强力抑制破骨细胞生成和吸收活性。
3.3 雌激素调节OVX大鼠RhoA-Pkn3-c-Src信号通路
TRAP与RhoA、Pkn3、c-Src、Pyk2的免疫荧光双标及平均荧光强度定量显示，OVX组破骨细胞中这四个蛋白表达均显著高于Sham组，雌激素干预后显著降低，说明雌激素可通过下调该通路抑制去卵巢增强的破骨细胞活性。
3.4 雌激素在体外减弱破骨细胞功能及F-actin细胞骨架组装
在RANKL诱导体系中，雌激素处理显著减少成熟破骨细胞数量、骨吸收陷窝面积和培养上清TRAP水平。F-actin染色显示雌激素降低
