《Mycobiology》：Taxonomic Reevaluation of Blackwellomyces Isolates Preserved in Korean Agricultural Culture Collection and Description of Two New Species
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Blackwellomyces是麦角菌科（Cordycipitaceae）中的一个虫生真菌属（Hypocreales, Sordariomycetes, Ascomycota），主要感染节肢动物幼虫，特别是鳞翅目（Lepidoptera）幼虫。尽管具有重要的生
Blackwellomyces是麦角菌科（Cordycipitaceae）中的一个虫生真菌属（Hypocreales, Sordariomycetes, Ascomycota），主要感染节肢动物幼虫，特别是鳞翅目（Lepidoptera）幼虫。尽管具有重要的生态意义，该属在韩国仍研究不足。在对韩国农业菌种保藏中心（KACC）保存的韩国Cordyceps sensu lato菌株进行重新鉴定过程中，研究人员发现有12株菌株属于Blackwellomyces属。因此，本研究旨在准确鉴定并阐明这些菌株的分类学地位。研究人员利用分子标记，包括内转录间隔区（ITS）、大亚基核糖体DNA（LSU）、翻译延伸因子1-α（TEF）以及RNA聚合酶II最大亚基（RPB1）和第二大亚基（RPB2），对12株Blackwellomyces菌株进行了鉴定。基于多位点序列数据的系统发育分析显示，这些菌株形成了两个 distinct 分支，形态学观察进一步支持其为该属内的新物种。由此，研究人员从韩国描述了2个新种：Blackwellomyces koreensis sp. nov. 和 Blackwellomyces larvicola sp. nov.。
虫生真菌是能够侵染并杀死昆虫及其他节肢动物，甚至非节肢动物微型无脊椎动物的微生物。它们常见于土壤中，不仅作为节肢动物种群的调节者，还通过与植物形成内生或附生关系而发挥重要的生态作用。在蛇口壳科（Cordycipitaceae）和线虫草科（Ophiocordycipitaceae）的所有物种，以及麦角菌科（Clavicipitaceae）的部分物种均被认为是虫生真菌。尽管这些真菌及其近缘种与其宿主表现出广泛的相互作用，但它们在致病过程中遵循相似的生物学原理。感染通常发生在经过一系列竞争性相互作用后穿透宿主表皮，成功感染需要真菌克服或逃避宿主防御。真菌系统发育学的最新进展显著完善了虫生真菌的分类学框架，增进了对其进化关系的理解，并促进了其作为环境友好型生物防治剂的潜在应用。
历史上，许多虫生真菌被归入Cordyceps sensu lato属，该属包含形态多样的物种。然而，近年来的系统发育研究表明Cordyceps s. l.代表多个不同的进化谱系，导致在Cordycipitaceae科内建立了多个属。其中，Spatafora & Luangsa-ard建立的Blackwellomyces属由Kepler等人基于Cordycipitaceae多基因系统发育分析，容纳了原先置于Cordyceps属中的数个物种。在该属建立时，Cordyceps cardinalis和C. pseudomilitaris被转移至新属，分别作为Blackwellomyces cardinalis（模式种）和B. pseudomilitaris。此后，不同地区陆续描述了更多物种，逐渐扩大了该属的多样性，包括2019年描述的B. lateris，2020年来自泰国的4个种（B. aurantiacus、B. calendulinus、B. minutus和B. roseostromatus），2023年来自中国的B. kaihuaensis，以及2024年分别来自中国和台湾的B. changningensis和B. taiwanensis。最近，2025年来自中国贵州描述了B. larvatus。因此，在本研究之前，全球共报道了11种Blackwellomyces。
Blackwellomyces Spatafora & Luangsa-ard于2017年建立，其独特特征在于子囊孢子具有不规则间隔的隔膜，成熟时不崩解为次生子囊孢子。该属最初从鞘翅目和鳞翅目昆虫幼虫中分离，全球已报道11种。Blackwellomyces通常产生黄色或橙色的子座，以及丝状、多隔的子囊孢子，成熟时不断裂成次生子囊孢子，区别于Cordycipitaceae其他成员。该属的无性型通常为Acremonium状、Evlachovaea状或Mariannaea状。在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上，菌落通常形成致密的白色菌丝体。一些菌落还产生易扩散到培养基中的红色色素。
在本研究中，研究人员重新检查了韩国农业菌种保藏中心（KACC）保存的Cordyceps sensu lato菌株，发现几株菌属于Blackwellomyces属。这一发现需要重新评估其分类归属。尽管近期的分类研究已基于形态和分子证据将Blackwellomyces从Cordyceps Fr.中分离出来，但KACC中保存的许多Cordyceps sensu lato菌株仍沿用分类修订前的原始名称。近期对KACC存档菌株的重新鉴定研究表明，使用现代分类学方法重新检查保藏菌株可以纠正鉴定错误，并发现先前未记录或新的分类群。因此，本研究旨在重新评估KACC中与Blackwellomyces相关菌株的分类地位，并基于其形态和分子特征描述新种。
研究人员检查了12株最初从韩国昆虫寄主上获得并保藏于KACC的Blackwellomyces菌株。冷冻保存的培养物在PDA上于25°C复苏以获得活跃生长的菌丝体。从在PDA上25°C培养14天的培养物中刮取真菌菌丝体，约50 mg新鲜菌丝体用于DNA提取。使用DNeasy? Plant Mini Kit提取基因组DNA。引物对ITS5/ITS4、LR0R/LR5、EF1-983F/EF1-2218R、RPB1AF/RPB1C和RPB2-5f2/RPB2-7cr分别用于扩增内转录间隔区（ITS）、大亚基核糖体RNA（LSU）、翻译延伸因子1-α（TEF）以及RNA聚合酶II最大亚基（RPB1）和第二大亚基（RPB2）。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳验证，随后由Macrogen Inc.测序。所有序列使用SeqMan 5.05软件编辑，每个位点的序列数据集使用MAFFT 7的G-INS-i算法单独比对，使用MEGA 11检查和优化比对，并将校正后的比对连接成组合数据集用于多位点系统发育分析。使用IQ-TREE构建最大似然（ML）系统发育树，基于ModelFinder选择最佳替换模型（TIM2+F+I+G4），分支支持率通过1000次超快自举重复评估。组合数据集包括12个Blackwellomyces菌株、16个属内参考物种，以及作为外群的Flavocillium bifurcatum YFCC 6101。所有菌株在PDA上25°C黑暗培养14天，记录菌落特征，并使用蔡司AXIO Imager A1微分干涉相差显微镜观察微观结构。
系统发育分析表明，所有KACC菌株均属于Blackwellomyces属，但不同基因区域区分物种的能力存在差异。在ITS树中，大多数KACC菌株与B. roseostromatus相近，但近缘种间关系不明确；LSU树也显示类似模式。相反，TEF树将KACC菌株清晰分为对应于两个新种的两组；RPB1和RPB2分析也清楚地将KACC菌株与已描述的Blackwellomyces物种区分开，并与组合数据集结果一致。基于ITS、LSU、TEF、RPB1和RPB2位点串联数据的系统发育分析显示，12株菌株聚在Blackwellomyces内。其中11株（KACC 43308、KACC 43309、KACC 43310、KACC 43311、KACC 44104、KACC 44105、KACC 44106、KACC 44111、KACC 44429、KACC 44430和KACC 48438）形成与B. roseostromatus分支（BCC 91358、BCC 91359和BCC 91360）相对的独立分支；剩余菌株KACC 43307形成一条长分支，与已知Blackwellomyces菌株在系统发育上隔离，表明其可能代表一个单独的分类单元。形态学观察显示，KACC 43308在PDA上产生白色至淡灰色菌落，并产生扩散到培养基中的明显紫红色色素；微观上具有透明、有隔膜的菌丝，单层瓶梗单生于束丝基部侧细胞上，产生倒卵形至椭圆形分生孢子。虽然与B. roseostromatus亲缘关系密切，但可通过更强的色素产生和分生孢子大小及形状的细微差异加以区分。KACC 43307的特征是在PDA上产生白色至奶油色菌落，边缘光滑；具有透明有隔菌丝、单层瓶梗和椭圆形分生孢子。形态上与其最近亲缘种B. pseudomilitaris相似，但缺乏培养中的红色色素，且系统发育上为独立谱系。
基于分子和形态分析，保藏于KACC的菌株被鉴定为新种候选。本研究是韩国首次报道Blackwellomyces新种。分类学部分描述了2个新种：
**Blackwellomyces koreensis D.H. Kang, J.M. Sung and S.B. Hong, sp. nov.**（图2）。MycoBank: MB863451。词源：种加词“koreensis”指采集地韩国。栖息地：未鉴定昆虫幼虫。模式：韩国济州，分离自未鉴定昆虫幼虫。模式菌株（holotype KACC 43308-H，以代谢不活跃状态保存；ex-type培养物KACC 43308）保藏于KACC。描述：瓶梗生于气生菌丝上，单生或每分枝2个轮生，安瓿形至稍烧瓶形，大小为(7–)8–11(–13) × (1.5–)2–3(–3.5) μm，基部卵形，略向颈部渐尖，颈部宽1 μm。分生孢子透明、光滑，多为椭圆形至略圆柱形，大小为(3–)3–6(–7) × (1–)1.5–2(–2.5) μm。菌落形态：在PDA上25°C 14天，菌落圆形，边缘整齐，产生大量白色气生菌丝，表面白色至浅灰色，无明显产孢；反面发育出明显的紫红色色素。在SDA上菌落相似，白色至橙色致密菌丝生长，反面也发育出明显的紫红色色素。注：B. koreensis与其最近亲缘种B. roseostromatus的区别在于其安瓿形至稍烧瓶形瓶梗，基部明显膨胀，分生孢子较小，椭圆形至略圆柱形；而B. roseostromatus产生圆柱形瓶梗，单生或2–5个轮生，分生孢子长椭圆形。此外，B. koreensis可通过瓶梗形态、较小分生孢子及培养特征区别于B. kaihuaensis、B. aurantiacus和B. changningensis。检查菌株：KACC 43308, KACC 43309, KACC 43310, KACC 43311, KACC 44104, KACC 44105, KACC 44106, KACC 44111, KACC 44429, KACC 44430和KACC 48438。
**Blackwellomyces larvicola D.H. Kang, J.M. Sung and S.B. Hong, sp. nov.**（图3）。MycoBank: MB 863452。词源：种加词指其发生在昆虫幼虫上。栖息地：未鉴定昆虫幼虫。模式：韩国济州，分离自未鉴定昆虫幼虫。模式菌株（holotype KACC 43307-H；ex-type培养物KACC 43307）保藏于KACC。描述：瓶梗生于气生菌丝上，单生或每分枝2–3个轮生，安瓿形至稍烧瓶形，大小为(6–)8–10(–11) × (1–)1.5–2.5(–3) μm，基部卵形，略向颈部渐尖，颈部宽1 μm。分生孢子透明、光滑，多为椭圆形至略圆柱形，大小为(3–)4–6(–7) × (1–)1.5–2(–2.5) μm。菌落形态：在PDA上25°C 14天，菌落圆形，边缘整齐，产生大量白色气生菌丝，表面白色至浅灰色，无明显产孢；反面保持淡色至浅奶油色。在SDA上菌落相似，白色致密菌丝生长，但反面中央发育出明显的浅橙色色素，边缘保持白色。注：B. larvicola与其最近亲缘种B. pseudomilitaris的主要形态区别在于瓶梗形态和大小。B. larvicola产生相对短而宽的安瓿形至稍烧瓶形瓶梗（8–10 × 1.5–2.5 μm），单生或2–3个轮生；而B. pseudomilitaris产生较长较窄的锥形至稍膨胀的单瓶梗产孢细胞（8–21 × 1–1.5 μm），从营养菌丝单生。B. larvicola的分生孢子椭圆形至略圆柱形，而B. pseudomilitaris的分生孢子椭圆形，但大小相似（4–6 × 1.5–2 μm）。分子证据进一步支持其分离，B. larvicola与B. pseudomilitaris ex-type菌株在TEF区域有15个核苷酸位点差异，在RPB2区域有36个核苷酸位点差异。
讨论部分指出，本研究结合遗传和形态学数据重新鉴定了提交至KACC的菌株。历史上，Blackwellomyces物种的分类通常基于形态特征，但近期研究表明补充分子和化学特征可显著提高真菌鉴定准确性。以往研究证明仅依赖ITS序列不足以准确鉴定Blackwellomyces物种，因此本研究采用多位点系统发育分析。基于ITS、LSU、TEF、RPB1和RPB2基因区域的系统发育分析支持2个新种的认定。ML分析确认了B. larvicola与B. pseudomilitaris之间的密切进化关系，以及B. koreensis与B. roseostromatus之间的密切关系。B. larvicola与B. pseudomilitaris的TEF区域有15 bp（2%）差异，RPB2区域有36 bp（4%）差异；B. koreensis与B. roseostromatus的ITS区域有6个核苷酸差异（1%），TEF区域有11个核苷酸差异（1%）。与近缘种（包括B. roseostromatus、B. kaihuaensis、B. aurantiacus、B. pseudomilitaris、B. calendulinus和B. taiwanensis）的比较形态学分析进一步支持了这两个韩国谱系的独特性。研究结论：本研究重新鉴定了提交至KACC的菌株，并因此确认了2个新种，即B. larvicola和B. koreensis。迄今为止，自该属从Cordyceps分离以来，全球已报道11种Blackwellomyces。其中6种记录于泰国（B. aurantiacus、B. calendulinus、B. lateris、B. minutus、B. pseudomilitaris和B. roseostromatus），B. taiwanensis报道自台湾，B. changningensis、B. kaihuaensis和B. larvatus报道自中国，模式种B. cardinalis记录于美国、中国、日本、韩国和泰国。值得注意的是，两个重新鉴定的菌株在分子和形态学综合特征上不同于所有先前报道的Blackwellomyces菌株。这些结果有助于扩展韩国Blackwellomyces的已知多样性，并强调使用整合分类学方法重新检查存档Cordyceps sensu lato菌株的重要性。此外，Blackwellomyces物种多样性的不断增加可能为该属的开发与利用提供宝贵资源。
