开发龙葵（Solanum americanum Mill.）高效遗传转化与基因组编辑方法——一种兼具药用与蔬菜价值的植物

《Horticulturae》：Developing Efficient Genetic Transformation and Genome Editing Methods for Solanum americanum Mill., a Medicinal and Vegetable Plant

　　

摘要 高效的组织培养和遗传转化系统对于植物微繁殖、次生代谢的分子研究、生物活性化合物的生物技术强化以及基因组编辑不可或缺。龙葵（Solanum americanum）是一种兼具蔬菜和药用价值的二倍体物种，但迄今仍未得到充分利用。该物种可产生多种具有药理活性的次生代谢物，包括糖苷生物碱（glycoalkaloids）、托烷类生物碱（tropane alkaloids）和白藜芦醇（resveratrol）。然而，针对该物种的稳定遗传转化和可靠的基因组编辑方案仍不成熟。在本研究中，研究人员建立了一种高效的龙葵遗传转化和基因组编辑方法。结果表明，在添加2 mg L?1 6-苄氨基嘌呤（6-BA）和0.1 mg L?1 α-萘乙酸（NAA）的MS培养基上，几乎所有叶片外植体均表现出阳性反应，四周内每个外植体平均产生25.85个不定芽。此外，在卡那霉素抗性芽中，约89.7%表现正常生长，超过75%表现出强烈的GFP表达及遗传性，并通过分子分析和花、果实及T1后代中的荧光检测得到证实。此外，研究人员成功利用该转化方法实现了八氢番茄红素脱饱和酶基因（SaPDS）的稳定基因组编辑。上述结果表明，为龙葵建立的组织培养、遗传转化和基因组编辑方法为该物种的大规模繁殖、次生代谢研究及生物技术改良提供了有价值的工具平台。

龙葵高效遗传转化与基因组编辑体系的建立——论文解读

一、研究背景与意义

植物是药理活性次生代谢物的重要来源，全球约80%的人口依赖传统药用植物治疗疾病，欧洲超过40%的医药产品来源于植物。然而，许多药用物种正面临栖息地丧失、气候变化、过度采挖、遗传变异以及生物活性化合物浓度低等多重威胁。为应对这些挑战，建立可持续的植物源化合物生产方式至关重要，而高效的繁殖、遗传转化和基因组编辑技术被视为有前景的解决方案。

茄属（Solanum）植物分类复杂，目前研究主要集中于马铃薯、番茄、辣椒等主要作物，而其他具有区域重要性的茄属物种研究不足。茄科包含多种具有重要药用价值的物种，其中茄属在传统医学中被广泛使用，用于治疗癌症、急性肾炎、咽喉痛、皮炎及COVID-19后遗症等。龙葵（Solanum americanum Mill.，2n = 2x = 24）是茄属中兼具营养蔬菜和重要传统药材双重价值的二倍体物种，含有茄解定（solasodine）、甾体糖苷生物碱和白藜芦醇等丰富的次生代谢物，在制药工业中被广泛利用。然而，其代谢物的生物合成途径在很大程度上仍未被探索，部分原因在于该物种缺乏高效的遗传工具。尽管龙葵基因组序列已发布，为推进功能基因组学和阐明代谢途径提供了新机遇，但该物种在微繁殖、遗传转化和基因组编辑方面仍面临重大挑战，阻碍了其研究与发展。因此，开发可靠的农杆菌介导转化系统结合CRISPR/Cas9基因组编辑技术，有望增强该物种的基因功能分析并促进未来的代谢工程研究。

二、主要技术方法

研究人员从浙江农林大学（中国临安）采集龙葵种子，经表面消毒后在MS培养基上萌发培养获得无菌苗。研究采用以下关键技术方法：第一，通过系统评估不同浓度6-BA与NAA的组合，优化叶片外植体不定芽再生条件；第二，利用高毒力农杆菌（Agrobacterium）菌株EHA105/pBI35S::GFP介导叶片外植体遗传转化，以卡那霉素为筛选标记；第三，通过GFP荧光显微观察、PCR检测、RT-PCR分析及T1后代荧光检测，对转基因植株进行分子鉴定与遗传稳定性验证；第四，利用CRISPRscan在线工具设计靶向八氢番茄红素脱饱和酶基因（SaPDS）的双sgRNA，构建pHEE401E-SaPDS编辑载体，通过农杆菌介导法实现龙葵的基因组编辑。

三、研究结果

3.1 叶片外植体不定芽再生

研究人员系统评估了6-BA单独或与0.1 mg L^?1 NAA组合对龙葵叶片外植体不定芽再生的影响。培养两周后，外植体周围形成绿色小结节；四周后各处理间再生效率出现显著差异。单独使用6-BA时再生效率相对较低，最适浓度2 mg L^?1时仅80%外植体产生不定芽，平均每外植体6.45个芽。而6-BA与0.1 mg L^?1 NAA组合显著提高了再生频率和程度：1 mg L^?1 6-BA加0.1 mg L^?1 NAA使95%外植体诱导出芽，平均每外植体14.25个芽；最高再生效率出现在2 mg L^?1 6-BA加0.1 mg L^?1 NAA处理中，几乎所有叶片外植体均产生响应，平均每外植体产生25.85个不定芽。培养五周后，伸长芽转移至无激素的? MS培养基，四周内大多数芽正常发育并生根。基于上述结果，含2 mg L^?1 6-BA和0.1 mg L^?1 NAA的MS培养基被选定用于后续转化研究。

3.2 龙葵的遗传转化

研究人员将40个叶片外植体接种稀释的农杆菌10–15分钟，在共培养培养基上于25°C黑暗条件下共培养3天，然后转移至筛选培养基。该实验重复两次。在筛选培养基上培养两周后，叶片外植体周围形成具有强烈GFP表达的致密绿色结节；四周后大量不定芽从结节分化。从每个外植体选取一个形态正常、生长快速的芽转移至含50 mg L^?1卡那霉素和300 mg L^?1头孢噻肟的? MS培养基诱导生根。在生根培养基中培养3–4周后，平均89.7%的植株正常发育，超过83.6%表现出强烈的GFP表达。

3.3 转基因龙葵的分子分析

研究人员从8株具有强烈GFP荧光的推定转基因植株叶片中提取总基因组DNA进行PCR扩增。野生型对照无扩增产物，而所有转基因植株均检测到GFP基因和卡那霉素抗性基因NPT II的特异性条带。半定量RT-PCR分析显示，8个独立转基因株系中有7个检测到清晰的GFP转录本表达，另一个株系无明显扩增，可能发生了转基因沉默。上述结果表明GFP基因已成功整合并在转基因龙葵中稳定表达。

3.4 花和果实中GFP表达的观察

为评估GFP在生殖组织中的表达稳定性，研究人员将7个转基因植株培养至成熟期，利用荧光显微镜观察新鲜花和未成熟绿色果实的GFP荧光。野生型花和果实中未检测到GFP信号，而所有7个转基因株系在花和果实中均表现出强烈的GFP表达。

3.5 T1后代中GFP基因的观察

为评估GFP基因在后续世代中的稳定遗传和表达，研究人员检测了源自7个转基因株系自交的T1幼苗。与野生型相比，在含200 mg L^?1头孢噻肟的MS培养基上培养的转基因植株表现出正常的表型特征，包括子叶大小、下胚轴长度和萌发时间。野生型幼苗中未检测到GFP信号，而所有检测的转基因株系在根、下胚轴和子叶中均观察到强烈的GFP荧光，证实GFP基因在转基因龙葵T1后代中稳定遗传并表达。

3.6 龙葵八氢番茄红素脱饱和酶基因的靶向编辑

为评估该转化方法作为基因编辑递送系统的潜力，研究人员针对龙葵的八氢番茄红素脱饱和酶基因（SaPDS）设计了位于第一外显子的一对特异性sgRNA，利用CRISPR-Cas9系统进行基因组编辑。转化六周后获得16个潮霉素抗性T0芽，其中3个为白化芽（18.75%）。Sanger测序分析显示，3个白化芽在靶位点1处均未检测到序列改变，但白化芽1在靶位点2区域存在26 bp缺失，白化芽2存在10 bp缺失，白化芽3表现出以‘TTA’替换‘CGTGCT’的独特序列修饰。这些缺失和序列改变可能解释了各芽中观察到的白化表型。结果表明，农杆菌介导的转化系统适用于龙葵的基因组编辑。

四、讨论与结论

建立任何植物物种有效微繁殖方案的关键步骤是优化各种植物生长调节剂之间的激素平衡。以往研究表明6-BA是促进多种植物芽诱导和微繁殖的有效细胞分裂素，而细胞分裂素与低浓度生长素NAA的组合可显著增强多种物种的芽形成。本研究发现，2 mg L^?1 6-BA与0.1 mg L^?1 NAA的组合为龙葵叶片外植体的快速高效芽再生提供了适宜的激素平衡，该简化再生系统可用于该物种的大规模繁殖。与先前在龙葵近缘种少花龙葵（S. nigrum）中报道的响应形成鲜明对比，这种差异响应可能归因于两个茄属物种在内源激素稳态和/或细胞分裂素受体敏感性方面的物种特异性差异。

遗传转化是增强宿主植物天然产物生物合成、工程化代谢物生产和基因组修饰的关键策略。本研究采用100 mg L^?1卡那霉素筛选龙葵转化体，经六周筛选后，超过89%的卡那霉素抗性芽表现正常生长，75%表现出强烈GFP表达，证明该浓度可有效用于龙葵转化体筛选。

稳定高效的基因组编辑工具的建立对于植物基因功能研究和育种应用至关重要。本研究利用新开发的农杆菌介导转化系统靶向龙葵PDS基因作为系统功能验证，16个潮霉素抗性T0芽中3个（18.75%）表现出白化表型，与PDS双等位基因破坏一致，Sanger测序证实了这些株系中的靶向突变。

本研究利用成熟叶片外植体在含2 mg L^?1 6-BA和0.1 mg L^?1 NAA的MS培养基上建立了龙葵高效植株再生方法，并在此基础上开发了快速可靠的农杆菌介导遗传转化系统。再生和转化方法均只需少量叶片材料，可在六周内完成。值得注意的是，超过75%的转化体在发育各阶段表现正常生长和稳定的GFP表达。此外，研究人员利用该转化方法实现了SaPDS的靶向编辑。这些简便快速的转化和基因组编辑方法将为龙葵基因功能和代谢途径的基础研究及生物技术改良提供有用工具。该论文发表于《Horticulturae》期刊。