活性氧响应性双氯芬酸纳米凝胶涂层提升生物心脏瓣膜的抗退变性能

《Acta Biomaterialia》：A reactive oxygen species-responsive diclofenac nanogel coating improves the anti-degeneration performance of bioprosthetic heart valves

　　

摘要

瓣膜性心脏病日益加重的疾病负担推动了生物瓣膜（BHVs）的使用，但其耐久性有限的挑战依然严峻。尽管钙化、慢性炎症和机械损伤被认为是导致生物瓣膜退化的重要因素，但它们在植入生物瓣膜中的相对贡献及相互作用仍未得到充分阐明，部分原因在于长期临床取出标本的直接病理证据有限。本研究中，对长期失败生物瓣膜与手术获取的非退化瓣膜进行对比病理分析，证实了失败瓣叶中存在显著的炎症和活性氧（ROS）蓄积，为材料设计提供了具有临床相关性的线索。基于这些发现，我们设计了一种含双氯芬酸的ROS响应型两性离子纳米凝胶，由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱（MPC）和双氯芬酸硫缩酮丙烯酸酯（DTA）组成，并将其固定于戊二醛固定心包（Glut）上，构建了多功能改性心包，命名为Glut-MPC-DTA。该纳米凝胶在水溶液中表现出良好的胶体稳定性和良好的生物相容性。在氧化条件下，可实现加速的ROS响应性药物释放，支持按需抗炎活性。与Glut相比，Glut-MPC-DTA改善了细胞相容性和血液相容性，减少了血小板、血细胞和炎症细胞的粘附，并显著抑制体内钙化。它还减轻了体外炎症细胞粘附和促炎反应，同时在体内抑制细胞浸润和促炎反应。转录组学分析进一步揭示了向免疫调节和炎症消退表型的转变，表明有效控制炎症可能缓解促退化的界面微环境，从而有助于中断炎症驱动的退化级联反应，最终改善生物瓣膜的耐久性。

意义声明

生物瓣膜（BHV）的失效仍是瓣膜置换的主要局限，但许多抗退化涂层是根据经验设计的，而非基于失败临床瓣膜的病理特征。本研究的显著意义在于将两个临床上观察到的退化线索——炎症和活性氧（ROS）蓄积——转化为疾病响应性生物材料界面。通过整合两性离子抗生物污染网络与ROS触发的双氯芬酸释放，该涂层旨在调节血液/材料和细胞/材料相互作用，同时抑制促进钙化退化的炎症微环境。除了改善单一瓣膜涂层外，本研究还展示了一种用于血液接触心血管生物材料的病理导向设计原则：材料界面可以被工程化改造以感知并对抗局部退化线索。

引言

随着人口老龄化和经济社会的持续发展，全球退行性瓣膜性心脏病（VHD）的发病率和疾病负担持续上升[[1], [2], [3]]，其中钙化性主动脉狭窄是主要形式，影响65岁以上人群的2%至7%[4,5]。对于大多数晚期VHD患者，瓣膜置换仍是唯一有效的治疗方法[6,7]。近年来，生物瓣膜（BHVs）越来越多地用于VHD的治疗[[8], [9], [10]]，这归因于其与机械瓣相比具有优异的生物相容性、良好的血流动力学性能以及无需终生抗凝[11,12]。尽管其在临床中广泛使用，但耐久性有限仍是核心挑战。目前，生物瓣膜的中位使用寿命约为8至15年[13,14]。除手术相关的早期失效外，生物瓣膜的长期退化主要由进行性结构性瓣膜退化驱动，其中钙化、慢性炎症损伤和机械损伤协同作用[[15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23]]。随着生物瓣膜使用的增加以及向更年轻患者群体的转变，更好地阐明这些病理过程在植入生物瓣膜中如何相互作用，并将这些知识转化为针对性保护策略，对于提高瓣膜耐久性变得越来越重要。

现有证据表明，结构性瓣膜退化（SVD）并非仅仅是钙沉积或胶原疲劳的被动过程，而是一个涉及炎症、氧化应激、细胞外基质损伤、脂质沉积、钙化和机械负荷的多因素过程[21,[24], [25], [26], [27], [28], [29], [30]]。一些机制概念来源于对天然钙化瓣膜病和实验模型的研究[31]。然而，植入的生物瓣膜具有独特的生物和材料背景，包括异体抗原、残留戊二醛、无活力的交联基质且修复能力有限以及反复的机械负荷[[32], [33], [34], [35]]。因此，尽管SVD的主要贡献因素已被认可，但它们在临床失败生物瓣膜中的相对重要性及相互作用仍未得到充分界定，部分原因是临床上很少能获得用于病理分析的生物瓣膜。

针对日益增长的预防SVD的兴趣，近年来开发了多种生物瓣膜的抗退化改性策略[[36], [37], [38], [39]]。这些方法在改善表面生物相容性、内皮相容性以及抗血栓、炎症或钙化方面显示出部分益处[[40], [41], [42]]。尽管如此，接枝稳定性不足、保护效果的耐久性欠佳以及长期验证有限，仍然是进一步开发和评估这些改性策略的重要考量[8,[43], [44], [45], [46]]。因此，将失败临床生物瓣膜的病理观察与响应性生物材料设计相结合，可能为开发针对性抗退化策略提供更具有临床相关性的途径。

在本研究中，我们首先对长期失败的取出生物瓣膜和手术获取的非退化瓣膜进行了对比病理分析，以确定炎症和氧化应激是否是临床生物瓣膜失效的突出特征，以及是否可以作为材料设计线索。在这些观察的指导下，我们构建了一个共价固定化两性离子纳米凝胶界面，该界面结合了抗蛋白吸附和活性氧（ROS）响应性双氯芬酸释放。具体来说，选择2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱（MPC）作为血液接触型两性离子组分，因为其强水合磷酸胆碱层可以减少非特异性蛋白吸附和细胞粘附。相比之下，将一种含双氯芬酸的硫缩酮甲基丙烯酸单体（称为DicloTA）引入共价固定化纳米凝胶中，将ROS响应性双氯芬酸有效载荷限制在瓣叶表面，从而最大限度地减少游离组分对血液的不可控暴露，同时允许对氧化刺激进行局部药物释放。随后在体外和体内模型中评估了其表面稳定性、细胞相容性、血液相容性、抗炎活性和抗钙化性能（图1）。本研究的主要进展是将失败临床生物瓣膜的病理证据转化为一种多功能界面，整合了抗污染保护与氧化应激响应性抗炎递送，从而为应对生物瓣膜退化提供了一种病理指导的材料策略。

章节摘要

材料与方法

详细的实验步骤见补充信息。主要实验设计和分析方法总结如下。

将炎症与生物瓣膜退化联系起来的组织学证据

我们收集了三个因非感染性原因退化的取出生物瓣膜。取出的生物瓣膜的代表性大体图像见图S1。瓣叶表面未观察到赘生物或明显血栓，但可见显著的瓣叶增厚和纤维撕裂。三个瓣膜均植入超过5年，平均植入时间为11.3年，且均被放置于主动脉位置。手术获取的对照生物瓣膜

结论

在本研究中，对失败临床生物瓣膜和手术获取的参考瓣膜的对比病理分析证实，退化瓣叶中存在显著的炎症和ROS蓄积。这些病理观察为开发一种ROS响应性含双氯芬酸两性离子纳米凝胶提供了依据，该纳米凝胶通过PEI介导的接枝固定于戊二醛固定心包上，构建了Glut-MPC-DTA。

Glut-MPC-DTA显示出良好的表面稳定性和

伦理声明

所有参与者或其法定代理人均已签署书面知情同意书，同意参与研究并发表文章。参与者的隐私权得到了尊重。

本研究包括器官或组织捐献者。本研究包含人类生物材料，已征得捐献者、其近亲属或法定代理人同意，用于本研究及文章发表。本研究所使用的样本并非来源于被处决者

数据可用性

数据将在合理请求下提供。

关于手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本手稿期间，使用了OpenAI的ChatGPT辅助语言润色。作者审阅和编辑了输出内容，并对手稿内容承担全部责任。

CRediT作者贡献声明

Zheng Chai：撰写初稿、可视化、软件、项目管理、方法学、调查、正式分析、数据整理、概念构思。Shufen Li：可视化、验证、方法学、调查、数据整理、概念构思。Tianyi Qu：可视化、项目管理、方法学、数据整理。Ming Chen：验证、软件、方法学。Ying Zhang：验证、软件。Yunfei Ling：撰写初稿、监督、资源。Weihua

Zheng Chai|Shufen Li|Tianyi Qu|Ming Chen|Ying Zhang|Yunfei Ling|Weihua Zhuang|Mao Chen