一种用于诱导细胞焦亡和可控释放瑞西莫德以增强肿瘤光免疫治疗的智能响应仿生纳米激动剂

《Acta Biomaterialia》：A Responsive Biomimetic Nanoagonist for Pyroptosis Induction and Controlled Resiquimod Release to Enhance Tumor Photoimmunotherapy

　　肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性限制了免疫治疗的有效性。尽管诱导肿瘤细胞焦亡并激活天然免疫是逆转该微环境的可行策略，但现有方法常受限于非靶向毒性和无法精确控制药物释放。为应对这些挑战，我们合成了具有恶唑烷结构的活性氧（ROS）响应型R848前药。随后，将氯化血红素（Hemin）偶联至牛血清白蛋白（BSA）分子，并还原BSA分子内的二硫键，以暴露游离巯基。接着，将R848前药连接至巯基上，并负载光敏剂Ce6，使其自组装形成HBSA@CR纳米激动剂。该策略不仅实现了比传统白蛋白纳米颗粒更高的载药能力，还保留了天然白蛋白的生物相容性和受体介导的细胞摄取优势。HBSA@CR可通过660纳米激光照射激活，通过光动力作用和酶催化高效产生ROS。体外实验表明，该纳米颗粒能够高效杀伤肿瘤细胞，通过Caspase-3/GSDME通路诱导焦亡，并触发R848的释放。在荷瘤小鼠模型中，HBSA@CR有效抑制了原发肿瘤的生长和肺部转移，并重塑了免疫抑制性TME。在肿瘤再挑战模型中，该策略成功预防了肿瘤复发，并赋予了持久的免疫记忆。此外，与免疫检查点抑制剂αPD-L1联用时，该纳米颗粒表现出协同治疗效果。所设计的纳米激动剂为联合光-免疫治疗提供了一个仿生平台，可实现R848的受控释放，诱导肿瘤细胞焦亡，重塑免疫抑制性TME，并激发持久的抗肿瘤免疫记忆。免疫抑制性肿瘤微环境是阻碍免疫治疗有效性的主要障碍之一，严重制约了其临床疗效。诱导焦亡和刺激天然免疫激活是重塑肿瘤微环境的有效策略，但现有方法常面临诱导焦亡缺乏选择性以及免疫激动剂全身给药毒性高等问题。本研究构建了纳米激动剂HBSA@CR，其保留了天然白蛋白的生物相容性和受体介导的肿瘤摄取能力。该纳米平台利用ROS诱导肿瘤细胞焦亡并驱动R848的受控释放，实现精确的局部焦亡诱导和天然免疫激活，有效重塑免疫抑制性微环境，并激发持久的抗肿瘤免疫记忆。免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的特征包括肿瘤抗原免疫原性低、树突状细胞（DCs）抗原呈递功能受损、细胞毒性T细胞浸润不足以及免疫抑制性细胞和因子的富积，这些特征共同促成了原发肿瘤的快速增长、强转移潜能以及癌症的高死亡率[1,2,3]。免疫治疗有望解决免疫抑制性TME的问题，但临床上只有少部分患者对现有的免疫疗法（如免疫检查点阻断疗法ICB）有应答[2]。因此，开发能够打破免疫抑制性TME的策略至关重要。焦亡是一种特殊的程序性细胞死亡（PCD）形式，可由炎性小体激活启动，导致细胞膜孔的形成，以及促炎信号因子和损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，从而触发抗肿瘤免疫反应[4,5,6,7]。这一过程为重塑免疫抑制性TME提供了一种可行的策略。强效的焦亡诱导剂包括金属纳米材料、铂类化疗药物以及微生物病原体相关分子模式（PAMPs）[8,9,10,11,12,13,14]。然而，它们在临床转化中的一个主要挑战是由于选择性低而导致的严重脱靶毒性，可能损害健康组织[15,16]。除了诱导肿瘤焦亡之外，对抗免疫抑制性TME的一种互补方法是使用靶向免疫刺激剂激活天然免疫系统[17]。其中，Toll样受体7/8（TLR7/8）激动剂利西美莫（R848）可有效促进DCs成熟，并驱动肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）向抗肿瘤M1表型重极化[18,19]。然而，像R848这样的小分子免疫刺激剂的临床应用受到了其半衰期短、肿瘤靶向能力差以及剂量限制性全身毒性的阻碍，全身给药可能引发严重的细胞因子释放综合征[20]。作为解决方案，在肿瘤部位特异性地受控释放R848可能是一种克服这些局限性的有前景的策略，这可以增强药物蓄积，最小化脱靶效应，并在TME内放大抗肿瘤免疫反应[19,21,22]。光动力疗法（PDT）是一种非侵入性且选择性高的癌症治疗方法，通过光照激活在肿瘤部位产生活性氧（ROS）来发挥抗肿瘤作用[23,24]。越来越多的证据表明，PDT诱导的ROS可有效触发肿瘤细胞焦亡[5,25]。然而，单纯PDT引发的抗肿瘤免疫往往太弱且短暂，无法克服免疫抑制性TME，这在很大程度上是由于ROS产生不足，从而限制了其作为单药治疗的疗效[5,23,25,26]。为解决此问题，人们探索了具有类酶活性的物质，通过一条与PDT光动力过程不同的催化驱动途径，将细胞内ROS提升至细胞毒性水平[25,27]。尽管这种机制很有前景，但有几项实际挑战阻碍了其广泛应用。例如，许多高效纳米酶表现出持续活跃的催化特征，这可能导致对健康组织的脱靶毒性[28,29]。另一个常见的局限性是聚集；某些模拟酶的材料，如氯化血红素（Hemin），倾向于在水性环境中聚集，从而显著降低其催化活性和稳定性[30,31]。在此，我们设计了一种具有类酶活性的仿生白蛋白基纳米颗粒，其中整合了光敏剂和ROS响应型R848前药，以诱导肿瘤细胞焦亡并激活抗肿瘤免疫。简而言之，氯化血红素（Hemin）通过酰胺键共轭至牛血清白蛋白（BSA）分子上，以防止血红素聚集并维持其酶活性。随后，还原所得Hemin-BSA（HBSA）中的二硫键以暴露巯基。同时，R848通过硫缩酮（TK）连接子与恶唑烷基团共轭，形成R848-TK-Mal前药。该前药随后通过恶唑烷与暴露的巯基之间的迈克尔加成反应连接到HBSA上[32]。与此同时，负载了光敏剂Ce6，最终与HBSA及R848-TK-Mal自组装形成HBSA@CR纳米颗粒（图1A）。这些纳米颗粒比通过常规反溶剂法制备的纳米颗粒实现了更高的载药能力（DLC）。在660纳米激光照射下，Ce6产生ROS，切割TK连接子并触发R848的快速释放。此外，HBSA@CR表现出过氧化物酶（POD）样活性，在H?O?存在下产生ROS。在细胞水平上，纳米颗粒毒性低，但在激光照射下能高效杀伤肿瘤细胞。此外，发现它们可诱导线粒体损伤，从而通过Caspase-3/GSDME通路触发焦亡。这一过程导致DAMPs的释放，这是免疫原性细胞死亡（ICD）的特征。在4T1皮下肿瘤小鼠模型中，HBSA@CR有效抑制了肿瘤生长，增加了肿瘤引流淋巴结（TDLNs）中成熟DCs的比例，使TAMs从M2向M1表型极化，并增强了CD8? T细胞在肿瘤中的浸润。此外，HBSA@CR有效抑制了脾脏中的全身调节性T细胞，进一步促进了TME的重塑。纳米颗粒还抑制了肿瘤细胞的肺部转移，建立了持久的抗肿瘤免疫记忆，并与免疫检查点抑制剂αPD-L1联用时表现出优异的协同抗肿瘤效应（图1B）。总之，本工作提出了一种理性设计的仿生纳米激动剂，其中ROS作为触发器来控制R848的释放并诱导肿瘤细胞焦亡，为免疫抑制性肿瘤的联合光-免疫治疗提供了一项有前景的策略。试剂R848、2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）和1,3-二苯异苯并呋喃（DPBF）购自MedChemExpress LLC公司。叶绿素e6（Ce6）购自上海源叶生物技术有限公司。氯化血红素、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）、1,3-二苯异苯并呋uran（DPBF）、巯基乙酸、丙酮、乙腈、三氟乙酸（TFA）、二甲基亚砜（DMSO）、氢化铝锂（LAH）、四氢呋喃（THF）、二氯甲烷（DCM）、三光气、4-恶唑烷丁酸，HBSA@CR的合成与表征首先，按照图S1所示的方案合成了R848-TK-Mal前药。中间产物的结构通过1H NMR、13C NMR和液相色谱-质谱联用仪（LC-MS，图S2-S5）进行了确认。最终获得了高纯度的R848-TK-Mal，其1H NMR结果显示了分别对应于R848芳香质子、硫缩酮（TK）连接子上的甲基以及恶唑烷基团质子的特征峰（图2A）。为防止其结论总而言之，本研究开发了一种仿生纳米激动剂HBSA@CR，它具有高载药能力和与天然白蛋白相似的细胞摄取机制。对ROS作出响应后，自组装纳米颗粒能够实现R848的受控释放，与ROS诱导的肿瘤细胞焦亡协同作用以治疗肿瘤。这种工程化的纳米激动剂成功实现了DC成熟，将TAMs向M1表型重极化，并促进了细胞毒性T细胞的肿瘤浸润，作者贡献L.M.负责领导该项目、申请资金并提供总体指导。W.Z.设计了实验方法学。J.X.在W.Z.的支持下执行了大部分实验。数据分析与解释由W.Z.、J.X.、M.O.完成。J.X.、L.M.、Y.S.、Y.F.、X.W.、W.L.、Q.L.、H.L.、J.C.和Y.Y.进行了动物实验。初稿由W.Z.撰写，并由J.X.、M.O.和L.M.审阅和编辑。利益冲突作者声明不存在利益冲突。稿件准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明在准备稿件期间，作者使用了DeepSeek来检查写作中可能存在的语法错误。使用该工具后，作者对内容进行了审阅和编辑，并对已发表文章的内容承担全部责任。CRediT作者贡献声明**曾文锋**：撰写——初稿、方法学、调查研究、形式分析、数据管理。**谢军涛**：撰写——初稿、验证、调查研究、形式分析、数据管理。**沈叶琪**：调查研究。**付奕秋**：调查研究。**王新怡**：调查研究。**李文**：调查研究。**刘青云**：调查研究。**李瀚月**：调查研究。**曹佳慧**：调查研究。**俞永康**：调查研究。**肖继胜**：调查研究。**欧美通**：撰写——审阅与编辑、指导、软件，曾文锋 | 谢军涛 | 沈叶琪 | 付奕秋 | 王新怡 | 李文 | 刘青云 | 李瀚月 | 曹佳慧 | 俞永康 | 肖继胜 | 欧美通 | 梅琳