DipTRANS：一种改进的本体转化和基因组工程技术，适用于本氏烟草

《TRENDS IN Biotechnology》：DipTRANS: an improved method for in planta transformation and genome engineering in Nicotiana benthamiana

　　

技术成熟度

DipTRANS（Direct in planta Transformation，即植物体内直接转化）构成了一个模块化的、不依赖组织培养的转化平台，目前对应技术成熟度等级（TRL）4–5。其核心组成部分——包括发育调控因子（DR）介导的in planta再生、基于土壤的芽诱导、扦插支持的育性恢复以及病毒介导的基因切换——已在Nicotiana benthamiana（本氏烟）中经过系统验证，涵盖稳定转化、条件性基因激活、迭代基因编辑以及外源基因的切除。基于Agrobacterium（农杆菌）的DNA递送与病毒介导的瞬时调控的整合，建立了一个灵活的框架，可在单一实验流程中同时支持可遗传的基因组工程和不含外源基因的基因组工程。

全面规模化部署仍面临关键障碍。组成型DR表达可能带来发育代价，需要额外的缓解步骤，从而增加操作复杂性。非转基因芽的再生限制了通量，且当前工作流程仍需在再生后手动去除非转基因芽。此外，DipTRANS目前仅在N. benthamiana中进行了优化。当前实施方案高度依赖Agrobacterium介导的递送和系统性病毒感染，将其应用于其他植物物种需要针对具体物种优化DR、递送系统和基因组工程模块。要使DipTRANS迈向更高成熟度，需要鉴定多效性更低的DR、简化筛选或视觉筛选策略，并使用组织或发育阶段特异性调控元件以减少对病毒切除的依赖。围绕病毒载体和基因编辑的监管考量也将影响实验室以外的未来应用。

亮点

发育调控因子可以直接在土壤栽培植株上诱导in planta转基因芽的生成。

植物体内直接转化技术可在Nicotiana benthamiana中实现快速的、可遗传的转化，效率高达47%，且无需组织培养。

扦插繁殖可缓解发育缺陷并恢复in planta转基因芽的育性。

病毒介导的发育调控因子外源基因切除，使得可以使用同一发育调控因子进行多轮in planta转化。

病毒介导的基因切换可实现外源基因在in planta中的程序化激活。

植物体内直接转化技术整合了稳定DNA转化和瞬时病毒递送，为灵活的植物工程提供支持。

模块化的植物体内直接转化框架为将in planta转化技术扩展至更多植物物种提供了基础。

摘要

植物转化仍然受到劳动密集型的组织培养的制约。我们此前的研究表明，发育调控因子（DRs）的直接递送可在植株上诱导de novo分生组织，提供了一种有前景的转化方法。在本资源性文章中，我们提出了DipTRANS（Direct in planta Transformation，植物体内直接转化），这是Nicotiana benthamiana的一个优化后的、基于土壤的、可遗传转化平台，完全绕开了无菌培养。DipTRANS建立在DR诱导的de novo分生组织形成之上。在优化参数（包括调控因子组合、Agrobacterium菌株和浸润密度）之后，DipTRANS的转化效率可达46.7%。与调控因子表达相关的发育异常可通过基于扦插的繁殖和病毒诱导的外源基因切除来解决，从而获得可育的转基因后代。此外，DipTRANS通过病毒诱导的基因编辑支持无组织培养、无外源基因的迭代基因组修饰。总体而言，DipTRANS可在30天内生成转基因植物，并在90天内生成工程后代。该方法学提供了一个快速、多用途的平台，并为将直接in planta转化技术扩展至其他植物物种提供了蓝图。

图形摘要