桔小实蝇（Bactrocera dorsalis (Hendel, 1912)）中两个CYP6基因的上调与溴氰虫酰胺（Broflanilide）响应的关联

《Insects》：The Upregulation of Two CYP6 Genes Is Associated with the Response to Broflanilide in Bactrocera dorsalis (Hendel, 1912) (Diptera: Tephritidae)

　　

桔小实蝇（Bactrocera dorsalis (Hendel)）是一种全球性的重要检疫性害虫，溴氰虫酰胺（broflanilide）是一种具有防治该害虫潜力的新型杀虫剂。然而，桔小实蝇对溴氰虫酰胺的分子响应，特别是细胞色素P450（cytochrome P450, P450）基因的参与情况，仍知之甚少。为弥补这一研究空白，研究人员比较了在溴氰虫酰胺半数致死浓度（median lethal concentration, LC50）下暴露24 h后存活成虫的中肠（midgut）和脂肪体（fat body）转录组与相应对照组之间的差异。候选P450基因进一步通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）、RNA干扰（RNA interference, RNAi）和分子对接（molecular docking）进行验证。RNA-seq分析发现，在溴氰虫酰胺暴露存活组中，CYP6G8（log2FC = 11.84和6.32）和CYP6GX5（log2FC = 6.48和7.83）均表现出显著上调。qRT-PCR结果显示，CYP6G8在两个组织中均显著上调，而CYP6GX5在脂肪体中显著上调，但在中肠中仅呈现不显著的上调趋势。沉默CYP6G8使溴氰虫酰胺暴露后的死亡率从43.21%上升至64.14%，沉默CYP6GX5使死亡率从31.11%上升至87.07%。分子对接分析预测了两种蛋白与溴氰虫酰胺活性代谢物desmethyl-broflanilide（DM-8007）之间可能存在相互作用。这些结果将CYP6G8和CYP6GX5确定为在测试条件下与溴氰虫酰胺耐受性相关的候选P450基因，尽管其直接的生化功能仍有待确定。

论文解读：桔小实蝇对溴氰虫酰胺响应的分子机制研究

一、研究背景与科学问题

桔小实蝇（Bactrocera dorsalis (Hendel)）是一种入侵性强、全球范围内具有重要经济意义的检疫性害虫。其繁殖能力高、扩散速度快、寄主范围广，导致其在新地区能够成功定殖和扩散。在中国，桔小实蝇最初仅局限于南方部分地区，但已逐步扩展至华南大部分地区，并近年向北越过长江扩散。其幼虫通过内部取食危害果实，引起腐烂或早落，造成严重的经济损失。化学杀虫剂仍是该类害虫防治体系的主要手段，但随着长期大量使用，田间种群已对有机磷类、拟除虫菊酯类和多杀菌素等多种杀虫剂产生抗性。抗性的快速发展降低了常用杀虫剂的防治效果，增加了生产系统中害虫管理的难度。因此，具有新作用机制的杀虫剂对于可持续抗性治理具有重要意义。

溴氰虫酰胺是一种新型间二酰胺类杀虫剂，归入IRAC第30组，于2020年在中国首次登记。该药剂通过接触处理表面表现出强杀虫活性，在昆虫体内被代谢为活性代谢物desmethyl-broflanilide（DM-8007），作用于抗狄氏剂（resistant-to-dieldrin, RDL）γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）受体，且与传统非竞争性拮抗剂结合位点不同。溴氰虫酰胺对草地贪夜蛾、小菜蛾和棉铃虫等多种重要经济害虫表现出高杀虫活性，并对包括桔小实蝇在内的多种实蝇科害虫具有毒性。然而，桔小实蝇对溴氰虫酰胺的分子响应，特别是细胞色素P450（P450）基因的参与情况，仍缺乏深入研究。

昆虫对异源物质的响应涉及多个代谢和转运过程，一般分为三个阶段：I相反应主要由细胞色素P450单加氧酶（P450s）和羧酸/胆碱酯酶介导的氧化、还原和水解反应；II相反应由谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）和UDP-糖基转移酶（UGTs）介导的结合反应；III相反应通过ATP结合盒（ABC）转运蛋白将代谢物转运排出。其中P450s在异源物质代谢和杀虫剂抗性中发挥重要作用。已有研究表明，杀虫剂暴露可诱导P450基因的转录上调。在桔小实蝇中，多个P450基因在马拉硫磷、阿维菌素和高效氯氰菊酯等杀虫剂胁迫下也表现出表达变化。尽管溴氰虫酰胺对桔小实蝇的毒力和亚致死效应已有评估，但其P450基因对溴氰虫酰胺的转录和功能响应仍基本未知。因此，开展该研究对于理解桔小实蝇对溴氰虫酰胺的生理适应机制，以及指导该杀虫剂在农业生产中的合理可持续应用具有重要意义。

二、研究内容与主要结论

该研究通过比较溴氰虫酰胺暴露存活组（BFL）与实验室对照组（LAB）在中肠和脂肪体两个代表性代谢组织中的转录组差异，筛选候选P450基因，并通过qRT-PCR、RNAi和分子对接进行验证。研究发现，BFL与LAB在两个组织中均存在大量差异表达基因。功能富集分析显示，中肠中显著富集了“细胞色素P450对外源物质的代谢”、“细胞色素P450药物代谢”和“谷胱甘肽代谢”等KEGG通路；脂肪体中除解毒相关通路外，还富集了“昆虫激素生物合成”和“蛋白质消化吸收”等通路。通过qRT-PCR验证，CYP6G8在两个组织中均显著上调，CYP6GX5在脂肪体中显著上调。RNAi沉默CYP6G8使溴氰虫酰胺暴露后死亡率从43.21%升至64.14%，沉默CYP6GX5使死亡率从31.11%升至87.07%。分子对接预测了CYP6G8和CYP6GX5与DM-8007之间可能存在相互作用。这些结果将CYP6G8和CYP6GX5确定为与溴氰虫酰胺耐受性相关的候选基因。该研究发表在《Insects》期刊，为理解桔小实蝇对溴氰虫酰胺的分子响应提供了基础，并可能有助于抗性风险评估和杀虫剂的合理使用。

三、主要技术方法

研究人员采用了多种关键技术方法开展研究。供试桔小实蝇实验室种群（LAB）采集自中国广东省广州市，已在实验室不接触任何杀虫剂的条件下饲养超过50代。使用溴氰虫酰胺商用制剂（Cimegra^?，100 g AI/L，悬浮剂），通过残留药膜法对4日龄成虫进行LC₅₀（7.559 mg/L）浓度暴露24 h，获得溴氰虫酰胺暴露存活组（BFL）和对照组（LAB）。对两个组织进行RNA-seq转录组测序，利用HISAT2比对到桔小实蝇参考基因组，DESeq2进行差异表达分析。候选P450基因通过qRT-PCR验证表达变化。采用RNAi技术，将靶基因dsRNA与Star Polycation（SPC）纳米载体复合后通过饲喂法递送，评估基因沉默对溴氰虫酰胺敏感性的影响。利用AlphaFold3预测蛋白三维结构，通过AutoDock Vina进行分子对接分析蛋白与DM-8007的潜在相互作用。

四、研究结果

1. 1.
   BFL和LAB在中肠和脂肪体中表现出转录组差异

比较转录组分析发现，脂肪体中有313个上调基因和541个下调基因，中肠中有492个上调基因和475个下调基因。在选定的P450基因中，CYP6G8和CYP6GX5在BFL的两个组织中均显著上调，而CYP18A1、CYP4AD1和CYP6GX2在脂肪体中特异性下调，CYP313E1在中肠中特异性下调。中肠GO富集分析突出显示了细胞外区域、转运蛋白活性、单加氧酶活性、血红素结合和膜等条目。KEGG通路分析显示“细胞色素P450对外源物质的代谢”、“细胞色素P450药物代谢”和“谷胱甘肽代谢”显著富集。脂肪体中GO条目主要富集于细胞外过程、蛋白水解活性和代谢功能，KEGG分析显示“昆虫激素生物合成”、“蛋白质消化吸收”、“谷胱甘肽代谢”和“细胞色素P450药物代谢”等通路显著富集。

1. 2.
   CYP6G8和CYP6GX5表现出不同的组织特异性上调模式

qRT-PCR结果与RNA-seq分析总体一致。CYP6G8在BFL的中肠和脂肪体中均显著上调。CYP6GX5仅在脂肪体中显著上调，在中肠中呈不显著的上调趋势。下调基因表现出明显的组织特异性表达模式：CYP6GX2在脂肪体中显著下调，CYP313E1在中肠中显著下调，CYP18A1和CYP4AD1在脂肪体中呈下降趋势但未达统计显著。

1. 3.
   沉默CYP6G8和CYP6GX5增加对溴氰虫酰胺的敏感性

CYP6G8的沉默效率为78.9%，CYP6GX5的沉默效率为93.2%。dsRNA处理显著增加了溴氰虫酰胺暴露后的死亡率：dsCYP6G8组死亡率达64.14%±3.03%，显著高于dsGFP对照组的43.21%±3.60%；CYP6GX5沉默使死亡率从31.11%±9.83%升至87.07%±5.09%。在无溴氰虫酰胺的对照处理中，dsGFP和靶基因dsRNA处理的成虫均未观察到死亡，表明基因沉默本身未造成可检测的死亡率。

1. 4.
   分子对接预测CYP6G8和CYP6GX5与DM-8007的潜在相互作用

拉氏图分析表明预测蛋白模型具有可接受的立体化学质量，CYP6G8和CYP6GX5分别有92.4%和94.1%的残基位于最适区域。对接模拟显示DM-8007可 accommodated 在CYP6G8和CYP6GX5的预测结合口袋中，预测结合能分别为?10.808 kcal/mol和?10.724 kcal/mol。CYP6G8-DM-8007结合模式中鉴定到与GLN-462的氢键和与ALA-307的卤键，以及多个疏水接触。CYP6GX5的预测结合模式包括与PHE-119的氢键和涉及SER-312的卤键。

五、讨论与结论

讨论部分指出，中肠和脂肪体作为昆虫重要的代谢组织，在BFL和LAB之间表现出不同的转录组模式。中肠中“血红素结合”和“单加氧酶活性”等GO条目以及P450相关KEGG通路的显著富集，表明P450相关过程参与了观察到的转录差异。脂肪体中除解毒通路外，还富集了昆虫激素生物合成、蛋白质消化吸收和营养代谢相关通路，表明存在更广泛的生理响应。尽管两个组织表现出不同的转录组模式，但P450相关通路在两个组织中均一致富集。

关于CYP6G8和CYP6GX5的功能，研究发现CYP6G8在马拉硫磷抗性种群中显著下调，与本研究中的表达上调形成对比，表明其调控可能取决于杀虫剂和生理背景。CYP6GX5在高效氯氰菊酯抗性种群中上调，与本研究结果一致，提示其可能参与对多种杀虫剂的响应。沉默CYP6G8或CYP6GX5后死亡率增加这一结果，不支持这两种P450主要将溴氰虫酰胺转化为活性代谢物DM-8007的假说，因为这些P450的沉默若减少活性代谢物形成，应降低毒性而非增加死亡率。因此，一个可能的解释是这些P450可能参与DM-8007或相关化合物的进一步代谢或解毒，但这仍属假说。

分子对接仅提供预测的结合构象和能量，不能证明物理结合或催化代谢。预测结合能在两个蛋白间非常接近，且未纳入其他P450蛋白或阴性对照进行比较，因此无法确定这些预测相互作用的特异性。AlphaFold3预测的结构也未经实验验证。未来需要使用重组CYP蛋白和溴氰虫酰胺及DM-8007作为底物的体外代谢实验来确定CYP6G8和CYP6GX5的实际生化功能。

研究存在若干局限性：BFL组由24 h溴氰虫酰胺暴露后存活的成虫组成，观察到的表达差异不能完全区分暴露相关变化与存活个体间的预先存在差异；仅考察了一个浓度（LC₅₀）和一个采样时间点（24 h）；使用商用制剂Cimegra^?而未设置制剂匹配对照，不能完全排除制剂添加剂的影响。RNAi实验设计为LC₅₀浓度下的初步功能测试，不能显示跨浓度的敏感性变化；CYP6GX5死亡率实验的重复数较少限制了统计稳健性。

研究结论为：该研究将CYP6G8和CYP6GX5确定为与桔小实蝇对溴氰虫酰胺暴露响应相关的候选P450基因。中肠和脂肪体的转录组分析表明BFL和LAB之间存在不同的组织特异性表达模式，P450相关通路在两个组织中均富集。RNAi实验进一步支持这些基因在测试条件下对溴氰虫酰胺耐受性有贡献，分子对接预测了DM-8007与两种P450蛋白之间可能的相互作用。从应用角度看，CYP6G8和CYP6GX5可作为进一步开展溴氰虫酰胺响应种群水平研究的候选基因。未来研究应确定这些基因的表达是否在不同地理种群中与溴氰虫酰胺敏感性一致相关，并通过直接代谢实验进一步阐明其生化功能。总体而言，这些发现为深入理解桔小实蝇对溴氰虫酰胺的响应提供了分子基础，并可能有助于抗性风险评估和杀虫剂的合理使用。