六种葫芦科植物叶绿体基因组密码子使用偏好性分析

《Genes》：Codon Usage Bias Analysis of Chloroplast Genomes in Six Cucurbitaceae Species

　　

中文摘要翻译 背景与目的：密码子使用偏好性（codon usage bias, CUB），即同义密码子的非均匀使用，在植物叶绿体基因组中普遍存在，并在基因表达和基因组进化中发挥重要作用。然而，针对葫芦科（Cucurbitaceae）不同属间CUB模式的系统性比较仍然有限。本研究旨在表征六种葫芦科植物叶绿体基因组的CUB模式并识别其驱动因素。方法：研究人员分析了六种葫芦科植物的完整叶绿体基因组，包括西瓜（Citrullus lanatus）、甜瓜（Cucumis melo）、黄瓜（Cucumis sativus）、南瓜（Cucurbita moschata）、冬瓜（Benincasa hispida）和苦瓜（Momordica charantia）。CUB模式通过ENC-plot、中性绘图（neutrality plot）和PR2-plot分析进行评估，所有分析均通过一套自定义的、可重复的Python工作流程实现。结果：六个物种的整体密码子使用偏好性较弱，且均明显偏好A/U结尾的密码子。在各物种内独立鉴定的候选偏好密码子（以下简称最优密码子）在很大程度上为六个物种所共有，但也检测到物种特异性密码子。结合ENC-plot、中性绘图和PR2-plot分析表明，自然选择而非突变压力是塑造这些基因组CUB的主导力量，尽管这些方法提供的是间接证据。结论：这些发现为葫芦科作物叶绿体基因工程中外源基因的密码子优化提供了参考。本研究开发的基于Python的工作流程也为传统的CUB分析方法提供了一种透明、可重复的替代方案。

论文解读文章

1. 研究背景与科学问题

密码子使用偏好性（codon usage bias, CUB）是基因组进化中的一个显著现象，指同义密码子在编码序列中的非随机使用。这种偏好性由突变压力、自然选择和遗传漂变等多种因素的共同作用塑造，其中自然选择和突变压力被认为是两个最主要的驱动力。已有大量研究表明，被子植物叶绿体基因组通常呈现A/T碱基富集和偏好A/U结尾密码子的特征。然而，关于驱动CUB的根本原因仍存在争议：一派观点认为自然选择是主导因素，它通过偏好与最丰富tRNA配对的密码子来提高翻译效率和准确性；另一派则认为依赖于上下文的突变动态足以解释大部分观察到的模式。这一争论凸显了在不同谱系中积累更多比较数据的必要性。

葫芦科（Cucurbitaceae）包含西瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜等重要的园艺作物，其叶绿体基因组已被广泛测序，且已有针对绞股蓝属（Gynostemma）、假贝母属（Actinostemma）、冬瓜属（Benincasa）和南瓜属（Cucurbita）等单个属或种的密码子使用研究。这些研究一致报告了较弱的整体偏好性、对A/U结尾密码子的偏好以及自然选择的主导作用。然而，大多数现有研究集中在单一属或单一物种，缺乏一个在统一分析流程下，整合ENC-plot、中性绘图、PR2-plot、相关性分析和最优密码子鉴定，进行跨属的系统性、方法学一致的比较研究。因此，本研究选取了分属于葫芦科三个不同族的六种代表性栽培物种——西瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜、冬瓜和苦瓜，旨在系统地比较它们叶绿体基因组的CUB模式，并量化自然选择与突变压力的相对贡献。该研究成果发表在《Genes》期刊上，可为葫芦科物种叶绿体基因工程中外源基因的优化提供参考。

2. 关键技术方法概述

研究人员从NCBI RefSeq数据库下载了六种葫芦科植物的完整叶绿体基因组序列，并使用GeSeq在线平台进行注释以生成GenBank（.gb）文件。随后，利用基于Biopython库的自定义Python脚本提取并过滤蛋白编码序列（CDS），筛选标准为起始密码子为ATG且长度大于300 bp。密码子使用分析完全采用Python 3.11.9环境，依赖Biopython、pandas、NumPy、Matplotlib、SciPy和Seaborn等包。分析内容包括：计算相对同义密码子使用度（relative synonymous codon usage, RSCU）、有效密码子数（effective number of codons, ENC，使用CodonW软件计算）、进行ENC-plot分析、中性绘图（neutrality plot）分析、PR2-plot（parity rule 2 plot）分析以及Pearson相关性分析。最优密码子的鉴定是通过比较每个物种内高CUB组（ENC值最低的前10%基因）和低CUB组（ENC值最高的后10%基因）的ΔRSCU值来完成的。此外，还利用四个代表性叶绿体基因（atpB, matK, ndhF, rbcL）的串联序列和完整叶绿体基因组序列，采用最大似然法（maximum likelihood, ML）重建了系统发育树。

3. 研究结果

3.1 密码子使用偏好性分析

总体而言，六个物种的叶绿体基因组显示出微弱的密码子使用偏好性，平均ENC值介于47.0至47.6之间，远高于35的强偏好阈值。GC含量在不同密码子位置上差异显著：第一和第二位点的GC含量（GC1和GC2）远高于第三位点（GC3），整体GC含量在38.0%至38.2%之间，符合叶绿体基因组典型的A/T富集特征。

3.1.1 RSCU分析

RSCU热图和条形图显示，六个物种的密码子使用模式高度相似。RSCU值大于1的密码子大多以A或U结尾，而RSCU值小于1的则主要以G或C结尾。在每个氨基酸内部，RSCU排名靠前的密码子均以A或U结尾，证实了对A/U结尾密码子的普遍偏好。

3.1.2 ENC-plot分析

在ENC-plot中，六个物种的实际ENC值分布在35至60之间，多数基因落在40-50区间内。在GC3含量0.2至0.4的范围内，大多数基因（83.9%）分布低于预期的ENC曲线，而少数基因（16.1%）位于曲线上方。这表明实际观察到的密码子偏好程度高于中性期望，暗示了选择压力的存在。

3.1.3 相关性分析

相关性分析显示，ENC与GC2呈极显著负相关（r = -0.2773, p < 0.001），与GC3呈极显著正相关（r = 0.2584, p < 0.001），但与GC1无显著相关性。GC1与GC2之间存在极显著正相关（r = 0.3494, p < 0.001），表明前两个密码子位置受氨基酸理化性质的约束而相对保守。GC3与GC1和GC2均无显著相关性，表明第三位点受到的结构约束较弱，更容易响应突变和选择压力。

3.1.4 PR2-plot分析

PR2-plot分析显示，所有六个物种的第三位点核苷酸使用均偏向Q4象限，表现为T₃ > A₃且G₃ > C₃，呈现出一致的偏倚模式，偏离了中心点（0.5, 0.5）所代表的完全均衡状态。

3.2 中性绘图分析

中性绘图分析结果显示，六个物种的GC12对GC3的回归斜率均非常低（范围0.016至0.151），且决定系数R²极小（0.0002至0.0148）。更重要的是，所有六个回归均未达到统计学显著性（所有p值 > 0.05），表明GC12与GC3之间不存在显著的相关性。这强烈反驳了突变压力作为主导力量的假说，因为如果突变压力占主导，GC12和GC3应在全基因组范围内协同变化。

3.3 系统发育树构建与拓扑结构分析

基于四个串联基因（atpB, matK, ndhF, rbcL）构建的最大似然（ML）树显示，六个物种形成两大分支：苦瓜与黄瓜聚为一支，而西瓜、冬瓜、甜瓜和南瓜构成另一支。引入石榴（Punica granatum）作为外群后，系统发育树的拓扑结构得到确认，苦瓜位于类群的最基部，其次是黄瓜。该树的所有分支都获得了100%的自举支持值。有趣的是，基于完整叶绿体基因组的系统发育树呈现出不同的拓扑结构，这表明不同数据集可能揭示了不同的进化信号。

3.4 最优密码子的鉴定与比较

在各物种内部独立鉴定的最优密码子数量从10个（苦瓜）到17个（甜瓜）不等。其中有八个密码子——ACT、ATT、CAA、CGT、GAC、GCT、GGT和TTC——为所有六个物种所共享。在这八个共享密码子中，五个以T（U）结尾，一个以A结尾，两个以C结尾。此外，也检测到了物种特异性的最优密码子。敏感性分析表明，这四个以A或U结尾的核心密码子（ACT、ATT、CAA、GAC）是最稳健的。

4. 讨论与结论总结

讨论部分指出，六个物种共有的八个最优密码子表明，在所研究的这六个栽培葫芦科物种中，密码子使用模式在很大程度上是保守的。多种证据支持自然选择是塑造CUB的主导力量：中性绘图中不显著的GC12-GC3相关性提供了反对突变压力主导的主要证据；ENC-plot中大多数基因位于预期曲线下方；PR2-plot中第三位点碱基组成偏离平衡态。这些模式与其他植物谱系的研究结果一致，进一步支持了自然选择的作用。研究还观察到，密码子使用偏好在不同氨基酸类型间分布不均，共享最优密码子主要编码非极性疏水氨基酸和极性不带电氨基酸。A/U结尾的偏好性在葫芦科乃至更广泛的被子植物叶绿体基因组中普遍存在，这可能与叶绿体的原核起源及其翻译系统的特性有关。研究对比了葫芦科与杜鹃花属（Rhododendron）的差异，推测进化时间尺度和分类学深度可能影响CUB模式的分化程度。本研究的应用价值在于，所鉴定的八个共享密码子可为这六种物种及其近缘种的叶绿体基因工程中外源基因的密码子优化提供初步参考。同时，研究者建立的基于Python的分析流程为传统的CUB分析方法提供了一种透明、可重复的替代方案。研究也指出了局限性，即本研究仅基于每种栽培物种的一个参考质体组，未来需要更广泛的取样来验证这些模式。

结论部分翻译如下：本研究系统地分析了六种葫芦科植物叶绿体基因组的密码子使用偏好性。在各物种内独立鉴定了最优密码子；其中八个，即ACT、ATT、CAA、CGT、GAC、GCT、GGT和TTC，为所有六个物种所共有，同时也检测到了物种特异性的最优密码子。这组共享密码子表明，在本研究所考察的六种栽培葫芦科物种中，密码子使用在很大程度上是保守的。中性绘图分析显示所有六个物种的GC12-GC3相关性均不显著，这反驳了突变压力起主导作用的观点，而ENC-plot和PR2-plot则提供了与自然选择作用相一致的补充描述性证据。相关性分析显示ENC与GC3呈极显著正相关（r = 0.2584, p < 0.001），与GC2呈极显著负相关（r = -0.2773, p < 0.001）。这八个共享的候选偏好密码子为这六种物种及其近缘种的叶绿体基因工程中外源基因的密码子优化提供了初步参考，但有待实验验证。