《Animals》：Wild Boar and Red Deer as Key Players in Coxiella Burnetii Circulation in the Wildlife–Livestock–Human Interface: Serological Analysis Using a Gaussian Mixture Model
编辑推荐：
贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）是Q热（Q Fever）的病原体，是一种全球分布的人畜共患病原体，也是一项“One Health”优先关注对象。尽管野生动物作为潜在储存宿主的认识日益加深，但有关C. burnetii在欧洲野生有蹄类动物中循环
贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）是Q热（Q Fever）的病原体，是一种全球分布的人畜共患病原体，也是一项“One Health”优先关注对象。尽管野生动物作为潜在储存宿主的认识日益加深，但有关C. burnetii在欧洲野生有蹄类动物中循环的数据仍然匮乏。本研究评估了葡萄牙中东部和东北部两个主要狩猎地区自由放养野猪（Sus scrofa）和马鹿（Cervus elaphus）对C. burnetii的暴露情况，并评估了一种商业多物种ELISA试剂盒在这两类宿主中的检测性能。2011年至2021年间，研究人员采用间接多物种ELISA，并结合基于高斯混合模型（Gaussian Mixture Model, GMM）推导的经验物种特异性阈值，对来自葡萄牙合法猎获动物的279份血清样本（162份野猪；117份马鹿）进行了检测。野猪总体血清阳性率为6.8%（95% CI: 3.4–11.8），马鹿为13.7%（95% CI: 8.0–21.3），其中贝拉巴伊沙（Beira Baixa，葡萄牙中东部）野猪的暴露水平高于特拉什奥斯蒙特斯（Trás-os-Montes，葡萄牙东北部）。制造商的反刍动物判定临界值仅将极少数动物判定为血清阳性（分别为0.6%和2.6%），且与物种特异性阈值的一致性仅为轻微至一般水平，凸显了建立经过验证的、适用于野生动物的诊断标准的必要性。这些发现证实了两个物种均存在对C. burnetii的暴露，提示其可能参与病原体在野生动物–家畜–人类界面的局部维持。研究结果进一步印证了将野生动物监测纳入国家Q热监测与防控策略的价值，以在“One Health”框架下同时保障公共卫生和畜牧业生产。
**研究背景与意义**
Q热（Q Fever）是由贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）引起的人畜共患传染病。该病原体为革兰阴性专性胞内菌，具有极强的环境抵抗力，可在低湿高温条件下长期存活，并能借助气溶胶和粉尘进行远距离传播。家养反刍动物（绵羊、山羊和牛）是其公认的主要储存宿主，但近年来野生动物在C. burnetii生态循环中的潜在作用日益受到关注。在欧盟范围内，2022年和2023年人类Q热确诊病例分别为719例和805例，呈持续上升趋势；葡萄牙2023年报告33例确诊病例，为2019年以来最高水平。然而，葡萄牙境内关于野生动物中C. burnetii流行情况的数据极为有限，尤其是在与人类活动密切相关的狩猎动物种群中。野猪（Sus scrofa）和马鹿（Cervus elaphus）是伊比利亚半岛数量持续增长的主要大型狩猎物种，其与家畜和人类在空间上的重叠日益加剧，可能为病原体跨物种传播创造机会。此外，目前市售的ELISA试剂盒主要针对家养反刍动物开发，尚未在野生动物物种中得到充分验证，缺乏物种特异性阳性/阴性参考血清和判定阈值，这严重制约了野生动物血清学监测的准确性和可比性。因此，本研究旨在填补葡萄牙及欧洲野生有蹄类动物Q热流行病学数据的空白，并探索适用于野生动物的血清学判定方法。
**研究方法概述**
研究人员于2011年至2021年间，在葡萄牙东北部特拉什奥斯蒙特斯和东部中部贝拉巴伊沙两个主要狩猎区域，采集了279份合法猎获动物的血液样本，其中野猪162份（特拉什奥斯蒙特斯89份、贝拉巴伊沙73份），马鹿117份（仅来自贝拉巴伊沙）。血清样本采用ID Screen? Q Fever间接多物种ELISA试剂盒（IDvet，法国蒙彼利埃）检测抗C. burnetii抗体，计算样本与阳性对照百分比值（S/P%）。判定阈值采用两种方法：一是制造商推荐的反刍动物判定标准（S/P% >50%为阳性），二是基于双组分高斯混合模型（Gaussian Mixture Model, GMM）和期望最大化（Expectation–Maximization, EM）算法推导的物种特异性经验阈值。区域间血清阳性率差异采用Fisher精确检验，两种分类方法的一致性采用Cohen's kappa系数评估。
**研究结果**
**3.1 物种特异性判定阈值的确定**
通过EM算法对S/P%值的频率分布进行双组分高斯混合建模，野猪的阴性和阳性亚群分布均值分别为8.2%（SD 3.7%）和25.9%（SD 13.7%），两条拟合分布曲线的交点对应的判定阈值为18.2% S/P；马鹿的阴性和阳性亚群均值分别为2.8%（SD 4.1%）和24.3%（SD 18.8%），判定阈值为13.3% S/P。
**3.2 野猪的血清阳性率**
采用GMM-derived阈值，野猪总体血清阳性率为6.8%（11/162；95% CI: 3.4–11.8%）。其中特拉什奥斯蒙特斯地区野猪血清阳性率为2.2%（2/89），贝拉巴伊沙地区为12.3%（9/73），两地区间差异具有统计学显著性（p < 0.05）。而采用制造商50%判定阈值时，野猪血清阳性率仅为0.6%（95% CI: 0.0–3.4%）。
**3.3 马鹿的血清阳性率**
贝拉巴伊沙地区马鹿的抗C. burnetii抗体阳性率为13.7%（16/117；95% CI: 8.0–21.3%），采用制造商50%阈值时则为2.6%（95% CI: 0.5–7.3%）。GMM方法将10份野猪样本（6.2%）和13份马鹿样本（11.1%）从阴性重新分类为阳性。
**3.4 两种分类方法的一致性**
Cohen's kappa系数显示，两种判定方法在马鹿中具有一般一致性（κ = 0.285），在野猪中仅有轻微一致性（κ = 0.15）。这一结果表明制造商针对家养反刍动物开发的判定标准可能不适用于野生有蹄类动物，采用固定的高阈值会低估野生动物的真实暴露水平。
**讨论与结论**
本研究提供了葡萄牙野生有蹄类动物暴露于C. burnetii的血清学证据，发现马鹿（13.7%）的血清阳性率高于野猪（6.8%），且贝拉巴伊沙地区野猪的暴露水平显著高于特拉什奥斯蒙特斯。这一区域性差异可能与该地区野猪和红鹿高密度、家养反刍动物为主的农业系统以及更频繁的野生动物–家畜–人类接触有关。贝拉巴伊沙地区拥有超过200个官方批准的狩猎场，狩猎活动密集，潜在的病原体传播风险更高。与西班牙（野猪1.0%、马鹿1.5%）和澳大利亚（野生鹿3.4%）等国家的报道相比，本研究检测到的血清阳性率相对较高，但应注意不同研究在地理区域、检测方法和判定标准上的差异，直接比较需谨慎。
从方法学角度看，本研究凸显了野生动物C. burnetii血清学解读的关键挑战。市售多物种ELISA试剂盒虽声称适用于多种哺乳动物，但制造商并未针对野猪和马鹿进行专门验证。采用制造商推荐的反刍动物判定阈值（>50% S/P）将导致大量弱阳性样本被误判为阴性，而GMM-derived物种特异性阈值能够更灵敏地识别血清反应性亚群。然而，GMM方法也存在一定局限性，如假设底层分布为双峰、所需样本量较大、以及当阳性亚群与阴性亚群重叠较大时阈值位置的不确定性增加。Cohen's kappa系数揭示两种方法仅具有轻微至一般的一致性，进一步支持了开发并验证野生动物特异性血清学工具和判定标准的必要性。
本研究结论指出，虽然研究提供了野猪和马鹿暴露于C. burnetii的血清学证据，支持将野生动物纳入One Health框架下的Q热监测计划，但并未证明这两个物种在生态系统中维持病原体循环或向家畜和人类传播的直接作用。未来的研究需进一步阐明野生动物在Q热流行病学中的具体角色及其在野生动物–家畜–人类界面的公共卫生意义。该研究为葡萄牙及欧洲野生动物Q热监测提供了重要的基线数据，为整合野生动物监测纳入国家Q热防控策略、保障公共卫生和畜牧业健康提供了科学依据。
