圈养棕熊与亚洲黑熊粪便病原菌组成及群落聚集机制

《Animals》：Fecal Pathogenic Bacteria Composition and Community Assembly Mechanisms in Captive Brown Bears and Asiatic Black Bears

　　

亚洲黑熊（Ursus thibetanus）和棕熊（Ursus arctos）是动物园中常见的圈养动物，圈养条件可能改变粪便病原菌群落并影响宿主健康，但相关系统研究仍然有限。本研究采用16S rRNA测序技术，表征了圈养棕熊和黑熊粪便病原菌的组成、多样性及群落聚集机制。棕熊样本聚集相对紧密，而黑熊样本分布较为分散，幼年与成年个体明显分离；成年黑熊的Shannon指数显著高于棕熊（p < 0.001）。动物病原菌（3.37%–80.30%）和人兽共患潜在病原菌类群（18.00%–96.60%）是两种熊类粪便中的优势类型，其中大肠杆菌（Escherichia coli）在多数样本中丰度最高，且成年个体中人兽共患潜在病原菌类群的丰度（83.67%）高于幼年个体（74.77%）。这些研究结果表明，圈养条件和宿主年龄塑造了熊科动物粪便中经MBPD注释的潜在病原菌群落，且MBPD注释的人兽共患潜在病原菌类群（包括E. coli-assigned序列）发生富集，为圈养熊的健康管理和潜在公共卫生风险评估提供了科学依据。

**研究背景与科学问题**

熊科（Ursidae）动物作为大型食肉动物的代表类群，在维持生态系统平衡和物种多样性方面具有重要的生态功能。亚洲黑熊（Ursus thibetanus）和棕熊（Ursus arctos）广泛饲养于各动物园和野生动物园中，圈养繁殖和迁地保护已成为其保护与救助的主要途径。然而，与自然栖息地相比，圈养环境在空间范围、活动模式、日粮组成及人类接触频率等方面存在显著差异，这些人为施加的圈养条件可能通过多种途径改变宿主的粪便微生态系统，增加疾病发生风险或导致亚健康状态。粪便微生物群落是由细菌（包括有益菌和病原菌）、真菌、古菌和病毒构成的复杂微生态系统，有益菌的高丰度和稳定的群落结构有助于维持粪便微生态平衡并促进宿主对难消化物质的降解；而病原菌丰度的增加不仅会破坏粪便微生物群落结构，还容易诱发腹泻和肠道炎症等疾病，其中人兽共患病原菌尤其值得关注——它们既能危害动物自身健康，也可通过接触、粪便污染等途径在人与动物之间传播，对动物园工作人员和游客的公共卫生安全构成潜在威胁。大肠杆菌作为一种广泛分布于人和动物肠道中的机会性病原体，其某些致病亚型已被证实与多种人兽共患传染病密切相关，是圈养野生动物粪便病原菌监测中不可忽视的关键目标。

以往对野生动物粪便微生物群的研究多集中于微生物多样性、优势门/属的组成结构及其与宿主生理状态和饮食结构的关联，而对粪便病原菌的具体类型、丰度分布及群落聚集机制的系统研究仍相对有限，特别是在圈养熊科动物中。此外，宿主年龄在粪便微生物群发育和稳定化过程中发挥重要作用：幼年个体的粪便微生物群通常处于建立和发育的早期阶段，群落结构相对不稳定，可能比成年个体更容易受到包括病原菌在内的外源微生物的定殖；然而针对圈养熊类粪便病原菌年龄差异的研究仍不充分。从群落生态学视角探究粪便病原菌群落的聚集机制——即随机过程（如迁移、扩散和随机定殖）与确定性过程（如宿主选择和环境过滤）的相对贡献——有助于阐明圈养环境如何塑造宿主粪便病原菌的组成格局。

基于上述背景，研究人员以中国安徽省巢湖市杨旗山动物园的圈养棕熊和山东省济南野生动物世界的圈养亚洲黑熊（包括成年和幼年个体）为研究对象，采集粪便样本作为胃肠道微生物群落的非侵入性替代指标，通过16S rRNA基因V3–V4区高通量测序结合多细菌病原体检测（multiple bacterial pathogen detection, MBPD）数据库，系统表征了粪便中潜在病原菌的组成、分类分布和相对丰度，比较了不同物种和不同生命阶段个体间粪便MBPD注释潜在病原菌群落多样性的差异，并利用中性群落模型（neutral community model, NCM）探讨了随机与确定性过程对群落聚集的相对贡献。研究假设两种熊之间及成年与幼年个体之间，粪便MBPD注释潜在病原菌群落的组成和多样性以及聚集过程的相对贡献存在差异。该研究论文发表于《Animals》。

**关键技术方法**

研究人员采用16S rRNA基因V3–V4区高通量测序技术。样本来源为安徽省巢湖市杨旗山动物园的10份棕熊粪便样本（编号UA1–UA10，均为5岁个体，其中6份来自雌性、4份来自雄性）和山东省济南野生动物世界的10份亚洲黑熊粪便样本（编号UT1–UT10，其中UT1–UT7为4–4.5岁成年雄性，UT8–UT10为约3月龄、性别未知的幼年个体）。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit提取粪便总DNA，以338F/806R通用引物扩增16S rRNA基因V3–V4高变区，在Illumina HiSeq 2500平台进行2 × 250 bp双端测序。测序数据经Fastp软件质控和EasyAmplicon软件流程进行引物去除、双端拼接、ASV推断及嵌合体过滤，并以最小样本测序深度进行抽平。随后应用MBPD流程（UCLUST算法，置信阈值0.8）对ASV代表序列进行比对注释，鉴定潜在病原菌类群并生成物种水平相对丰度表。α多样性采用Wilcoxon秩和检验比较Richness指数和Shannon指数；β多样性基于Bray–Curtis距离矩阵进行主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS），并采用PERMANOVA统计检验分组效应；群落聚集机制采用Sloan中性群落模型（NCM）分别对三组进行拟合。

**研究结果**

*3.1 测序数据概述*

对20份粪便样本进行16S rRNA基因V3–V4区高通量测序，质控后共获得1,229,835条有效序列，平均每样本61,491.75条；经ASV去噪和嵌合体去除后共聚类823个ASV。物种累积箱线图和稀释曲线均呈现先快速上升后逐渐平缓并最终达到饱和平台期的趋势，所有样本Good's coverage指数均超过99%，表明测序深度足以高置信度反映样本中真实的微生物物种组成，为后续多样性及群落结构比较提供了可靠的数据基础。

*3.2 圈养亚洲黑熊和棕熊粪便病原菌多样性*

基于Bray–Curtis距离矩阵的NMDS和PCoA分析显示，两种排序方法的结果高度一致：棕熊（UA）组样本在排序空间中相对集中、紧密聚集，样本间差异较小；而亚洲黑熊（UT）组样本分布明显更为分散，呈现显著的组内异质性。值得注意的是，黑熊组表现出清晰的年龄相关分化模式——幼年黑熊样本（UT8、UT9、UT10）聚集在排序图原点附近，与成年黑熊样本（UT1–UT7）在排序空间中明显分离。PERMANOVA分析表明，物种因素（棕熊vs.亚洲黑熊）显著解释了β多样性的变异（R2 = 0.356, p = 0.001）。进一步将黑熊组细分为幼年黑熊组（UTY）和成年黑熊组（UTA）后进行三组α多样性比较：Richness指数方面，三组间均未检测到统计学显著差异（p > 0.05），表明粪便MBPD注释潜在病原菌群落的物种丰富度在三组间总体相似；Shannon多样性指数方面，成年黑熊组的粪便病原菌群落多样性显著高于棕熊组（p < 0.001），幼年黑熊组数值上介于棕熊组和成年黑熊组之间，但与棕熊组相比未达到显著水平（p > 0.05）。这表明圈养黑熊粪便病原菌多样性的显著升高主要归因于成年个体，而幼年黑熊的病原菌多样性特征更接近棕熊，尚未表现出成年个体的显著升高。

*3.3 粪便病原菌组成*

分类学分析显示，黑熊和棕熊粪便样本中检测到的病原菌可大致归为动物病原菌（相对丰度范围3.37%–80.30%）和人兽共患病原菌（相对丰度范围18.00%–96.60%）两大类，二者共同构成各样本病原菌群落的主要组分。物种间差异方面，圈养棕熊粪便中动物病原菌的平均相对丰度（59.07% ± 17.49%）高于人兽共患病原菌（40.65% ± 17.27%），表明棕熊粪便病原菌群落以动物病原菌为主；圈养黑熊组内则呈现明显的年龄相关差异——成年黑熊粪便中MBPD注释人兽共患潜在病原菌类群的平均相对丰度（83.67% ± 15.12%）数值上高于幼年黑熊（74.77% ± 11.97%），提示黑熊粪便中人兽共患病原菌的比例随年龄增长趋于进一步升高。在物种分类水平上，除黑熊样本UT5外，其余所有样本中相对丰度最高的病原菌均为大肠杆菌（一种人兽共患病原菌），其相对丰度在样本间波动较大，范围为19.30%–95.50%，表明E. coli-assigned序列在多数样本中丰度较高，是两种圈养熊群体粪便中检出最多的MBPD注释潜在病原菌类群；但受16S rRNA V3–V4测序分辨率所限，该注释并不能确认特定致病性大肠杆菌谱系的存在或其毒力潜力。UT5样本是明显的例外——该样本中相对丰度最高的病原菌为食醇鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium spiritivorum，动物病原菌，相对丰度17.60%），大肠杆菌居第二位（15.00%），这种独特的病原菌组成模式与UT5在NMDS和PCoA排序分析中独立分布在排序空间边缘的显著偏离现象相互印证。

*3.4 MBPD注释潜在病原菌群落聚集机制*

研究人员分别对棕熊组（UA）、成年黑熊组（UTA）和幼年黑熊组（UTY）拟合Sloan中性群落模型（NCM）以探索性可视化潜在病原菌ASV的发生—丰度关系。平台报告的模型拟合值（R2）在三组中均低于0.5：棕熊组R2 = 0.464，成年黑熊组R2 = 0.045，幼年黑熊组R2 = 0.235。复合参数Nm值方面，棕熊组为683，成年黑熊组为945，幼年黑熊组为13,988，后者数值上高于前两组。由于未进行正式的统计比较，NCM结果仅作为探索性模型拟合模式呈现，不应解释为各组间随机过程、确定性过程、扩散或迁移差异的证据。

**讨论与结论**

在MBPD注释潜在病原菌组成方面，本研究中所有样本的人兽共患病原菌相对丰度均超过18%，部分样本高达96.60%，但由于注释基于16S rRNA基因测序和MBPD数据库，这些数值代表注释类群的相对丰度，并不能确认病原菌株的存在、毒力、感染或疾病状态。物种水平上，大肠杆菌在绝大多数棕熊和黑熊样本中相对丰度最高，与其他圈养动物粪便微生物群中大肠杆菌广泛优势的报道一致。作为典型的人兽共患病原体，大肠杆菌广泛存在于饲养员、游客和圈舍设施等环境介质中，其在圈养熊粪便中的高检出频率和高丰度进一步支持了圈养环境暴露与粪便病原菌富集之间潜在关联的假说。幼年黑熊样本采集时仅0.25岁，处于可能重叠断奶和乳汁向固体食物过渡的发育/生命阶段，其粪便微生物群尚未形成稳定的物种特异性结构，病原菌组成模式可能更多受外部环境暴露的塑造；NMDS和PCoA分析中幼年黑熊与来自另一动物园的棕熊样本在排序空间中出现一定重叠，而与同动物园的成年黑熊样本分离更清晰，支持年龄效应可能反映了与生命阶段相关的发育转变而非单纯的日历年龄。基于研究结果，研究人员建议在常规饲养管理中加强饲养环境和接触物品的清洁消毒（如常规酒精消毒措施），以减少人兽共患病原菌向圈养个体粪便传播的机会。

本研究结论为：通过16S rRNA测序和MBPD数据库，研究人员表征了圈养棕熊和黑熊（成年和幼年）粪便中MBPD注释的潜在病原菌群落。人兽共患病原菌，尤其是大肠杆菌（Escherichia coli），在三个组中均占主导地位，成年黑熊表现出最高的丰度和多样性，而幼年黑熊与棕熊相似，反映了其未成熟的粪便微生物群。中性群落模型拟合显示各组解释力均较低（R2 < 0.5），表明可能存在非中性影响，但无法得出圈养管理是粪便病原菌群落聚集的主要确定性驱动因素的结论。这些发现为圈养熊科动物的粪便病原菌提供了基线数据，未来需要纳入野生对照和纵向采样以进一步阐明圈养、宿主年龄和物种在塑造这些群落中的作用。