《Animals》：Comparative Lung Bacterial Community Profiles in Pneumonic and Non-Pneumonic Akkaraman Lambs
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：绵羊肺炎是一种多因素呼吸道疾病，但与病理学确诊的羔羊肺炎相关的细菌群落变化仍未得到充分表征。本研究通过整合大体及组织病理学检查与16S rRNA基因扩增子测序，对非肺炎与肺炎阿卡拉曼羔羊的肺部细菌微生物群进行了研究。最终数据集包含15只非肺炎和14只肺炎羔羊
：绵羊肺炎是一种多因素呼吸道疾病，但与病理学确诊的羔羊肺炎相关的细菌群落变化仍未得到充分表征。本研究通过整合大体及组织病理学检查与16S rRNA基因扩增子测序，对非肺炎与肺炎阿卡拉曼羔羊的肺部细菌微生物群进行了研究。最终数据集包含15只非肺炎和14只肺炎羔羊的肺样本。两组间的α多样性无显著差异，而基于Bray–Curtis（R2 = 0.093，p = 0.001）和加权UniFrac（R2 = 0.117，p = 0.006）距离的细菌群落组成存在显著差异，且多变量离散度无显著差异。在属水平上，经错误发现率校正后，曼海姆菌属（Mannheimia）在肺炎肺中的相对丰度显著更高，且是唯一同时被ANCOM鉴定为差异丰度的属。支原体属（Mycoplasma）、梭杆菌属（Fusobacterium）和Trueperella属在肺炎肺中的相对代表性更高，而不动杆菌属（Acinetobacter）和嗜冷杆菌属（Psychrobacter）则呈现相反趋势。患病率分析进一步显示两组间分类单元分布存在显著差异。总体而言，自然发生的肺炎与肺部细菌群落组成的显著改变相关，而非样本内多样性的普遍丧失，其中曼海姆菌属（Mannheimia）是肺炎相关属水平信号中最强的。
论文解读文章
一、研究背景与问题
羔羊肺炎是绵羊生产中造成经济损失和动物福利问题的重要呼吸道疾病，可导致发病率、死亡率、生长性能下降及治疗成本增加。该病具有多因素致病特征，涉及传染性病原体、宿主易感性与免疫状态、环境条件及饲养管理相关应激因素之间的复杂相互作用。在细菌性病原体中，巴斯德菌科（Pasteurellaceae）成员，尤其是溶血性曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）、海藻糖比伯斯坦菌（Bibersteinia trehalosi）和多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida），常与羔羊肺炎相关，有时呈现混合感染状态。然而，基于培养的分离方法和靶向分子检测可能无法全面反映肺炎肺病变相关的更广泛细菌群落特征。尽管呼吸道微生物组研究日益受到关注，但关于绵羊肺部相关细菌群落的信息仍然有限，特别是在自然发生肺炎的幼龄羔羊中，形态学确诊的肺炎病变与肺部细菌群落整体结构之间的关系尚未得到充分表征。因此，开展将病理学检查与细菌群落分析相结合的研究，对于更全面理解羔羊肺炎的微生物学基础具有重要意义。
二、研究设计与方法
研究人员于2026年1月至6月期间，从土耳其埃拉泽省菲拉特大学兽医学院病理学系收集了15–30日龄阿卡拉曼羔羊的肺组织样本。在106只送检绵羊中，82只小于三个月龄，其中19只羔羊表现出与肺炎一致的大体病理学改变；排除3只严重自溶或腐败样本和1只其他品种样本后，最终纳入全部15只符合条件的肺炎阿卡拉曼羔羊。同时选取15只死于确诊肺外疾病且无大体或显微镜下肺炎证据的同龄非肺炎阿卡拉曼羔羊作为对照。样本采集后分为两部分，一部分经10%中性缓冲福尔马林固定用于病理学检查，另一部分于?80 °C保存用于微生物组分析。肺炎诊断基于大体检查中肺实变、肝样变、肿大及质地变硬等特征性表现，并经组织病理学检查确认肺泡腔内存在炎性细胞或炎性渗出物。研究人员采用16S rRNA基因V3–V4区域扩增子测序技术，使用341F和785R引物对进行扩增，在Illumina NovaSeq 6000平台进行2 × 250 bp双端测序。生物信息学分析使用QIIME 2版本2022.11流程，经Cutadapt去除引物、DADA2进行降噪和嵌合体去除，基于SILVA 138（99%）参考数据库进行分类学分配。多样性分析在每样本10,000条序列的稀疏化深度下进行，α多样性采用观测ASV数、Shannon多样性、Faith系统发育多样性和Pielou均匀度评估，β多样性采用Bray–Curtis相异度和加权UniFrac距离评估。统计分析包括Kruskal–Wallis检验、PERMANOVA、PERMDISP、Mann–Whitney U检验（Benjamini–Hochberg错误发现率校正）及ANCOM差异丰度分析。
三、研究结果
3.1 肺炎肺呈现一系列大体病变，以急性支气管肺炎为主
大体病理学检查显示肺炎肺病变严重程度不一，研究人员根据病变范围和严重程度将肺炎病例定性分为轻度（P1–P3）、中度（P4–P7）、重度（P8–P11）和极重度（P12–P15）四组。颅侧肺叶最常受累，表现为不同程度的实变伴暗红色至暗紫色变色。最严重肺叶的胸膜表面覆盖纤维蛋白性或纤维蛋白脓性渗出物，并观察到多灶性脓肿和局灶性坏死。组织病理学检查确认所有肺炎病例均存在肺炎，以急性炎性病变为主，组织病理学类型包括急性卡他性支气管肺炎（n = 3）、卡他性化脓性支气管肺炎（n = 3）、化脓性支气管肺炎（n = 1）、化脓性坏死性支气管肺炎（n = 2）、纤维蛋白出血性支气管肺炎（n = 2）、纤维蛋白化脓性支气管肺炎（n = 3）和以燕麦细胞形成为特征的纤维蛋白性肺炎（n = 1）。主要组织病理学发现包括肺泡毛细血管充血、肺泡内水肿、中性粒细胞浸润、纤维蛋白沉积、出血、多灶性坏死和燕麦细胞形成。非肺炎肺无大体或显微镜下炎性病变证据。
3.2 肺炎与群落组成改变相关，但α多样性无显著差异
一例肺炎样本（P14）文库制备失败，最终29个样本（15例非肺炎和14例肺炎）进入测序和下游分析。DADA2流程共处理2,708,855条双端读长，去噪、双端合并和嵌合体去除后保留1,776,928条非嵌合读长，产生30,646个ASV；去除未分配特征和仅分类至细菌域水平的特征后，最终数据集包含4,433个ASV和1,299,088条读长。α多样性分析显示，两组在观测ASV数（p = 0.150）、Shannon多样性（p = 0.239）、Faith系统发育多样性（p = 0.256）和Pielou均匀度（p = 0.458）方面均无显著差异。相比之下，β多样性分析显示两组间微生物群落组成存在显著差异。基于Bray–Curtis相异度（pseudo-F = 2.774，R2 = 0.093，p = 0.001）和加权UniFrac距离（pseudo-F = 3.570，R2 = 0.117，p = 0.006）的PERMANOVA均确认了群落组成的显著差异。PERMDISP分析显示两种距离矩阵的组间多变量离散度均无显著差异（Bray–Curtis p = 0.883；加权UniFrac p = 0.142），表明PERMANOVA结果并非由组内离散度不均所致。
3.3 分类学组成在非肺炎与肺炎肺间存在差异，曼海姆菌属（Mannheimia）成为主要差异丰度属
门水平上，变形菌门（Proteobacteria）在两组中均为优势菌门，在非肺炎肺中的平均相对丰度高于肺炎肺（60.9% vs. 51.1%）。厚壁菌门（Firmicutes）在两组间比例相近（18.1% vs. 18.9%），而梭杆菌门（Fusobacteriota）在肺炎肺微生物群中占比更高（14.6% vs. 3.3%）。拟杆菌门（Bacteroidota）在肺炎肺中的平均相对丰度也更高（11.3% vs. 8.6%），放线菌门（Actinobacteriota）则在非肺炎肺中占比更高（6.5% vs. 2.3%）。科水平上，非肺炎肺以莫拉菌科（Moraxellaceae，25.1%）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae，17.1%）和假单胞菌科（Pseudomonadaceae，16.0%）为主，而肺炎肺中巴斯德菌科（Pasteurellaceae，21.3%）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae，17.4%）、梭杆菌科（Fusobacteriaceae，10.6%）、支原体科（Mycoplasmataceae，8.8%）和拟杆菌科（Bacteroidaceae，6.1%）的平均相对丰度更高。属水平比较中，谷氨酸杆菌属（Glutamicibacter）在FDR校正后显示出最强的单变量差异（q = 0.007），主要存在于非肺炎样本中，而曼海姆菌属（Mannheimia）在肺炎肺中的相对丰度显著更高（q = 0.023）。在这些分类单元中，仅曼海姆菌属（Mannheimia）被ANCOM进一步鉴定为差异丰度（W = 209）。其他多个属呈现方向性差异，包括支原体属（Mycoplasma）、梭杆菌属（Fusobacterium）和Trueperella属在肺炎肺中相对丰度更高，而不动杆菌属（Acinetobacter）和嗜冷杆菌属（Psychrobacter）在非肺炎肺中相对丰度更高，但这些比较在5% FDR阈值下未保持显著性。
3.4 肺炎与高患病率肺分类单元分布模式的改变相关
患病率分析显示，非肺炎与肺炎肺之间高患病率细菌分类单元的分布存在显著差异。13个分类单元满足至少在一个研究组中患病率≥80%且组间患病率绝对差异≥20个百分点的可视化标准。其中，曼海姆菌属（Mannheimia）表现出显著的肺炎相关差异，在85.7%的肺炎肺中检出，而在非肺炎肺中仅为26.7%，同时肺炎肺中的平均相对丰度更高（16.8% vs. 0.1%）。相反，多个高患病率分类单元在肺炎肺中的患病率较低。谷氨酸杆菌属（Glutamicibacter）在80.0%的非肺炎样本中检出，但在肺炎样本中未检出；葡萄球菌属（Staphylococcus）的患病率从非肺炎肺的86.7%降至肺炎肺的21.4%。这些发现表明肺炎与肺细菌群落中高患病率成员的分布模式改变相关。
四、讨论与结论
研究人员指出，本研究发现自然发生的羔羊大叶性肺炎与肺部细菌群落组成的显著改变相关，而非样本内多样性的普遍丧失。α多样性无显著差异而β多样性存在显著差异的模式，反映了细菌分类单元身份和相对代表性的变化，而非丰富度、均匀度或系统发育多样性的整体下降。将微生物组分析与病理学检查相结合，为在形态学确诊的肺部疾病背景下解释群落改变提供了生物学框架。曼海姆菌属（Mannheimia）作为最一致的肺炎相关属，在FDR校正分析和ANCOM分析中均得到支持；支原体属（Mycoplasma）、梭杆菌属（Fusobacterium）和Trueperella属在肺炎肺中的相对代表性增加，与既往绵羊呼吸道研究结果一致。不动杆菌属（Acinetobacter）和嗜冷杆菌属（Psychrobacter）在非肺炎肺中相对代表性更高，但其生态学意义尚不确定。研究人员强调，疫苗接种和饲养管理可能是影响羔羊肺炎相关细菌模式的因素，但本研究未获取相关数据。研究局限性包括样本量较小、横断面尸检设计无法评估时间关系、非肺炎羔羊死于肺外疾病而非系统健康对照、以及16S rRNA基因扩增测序在物种水平分辨率上的固有局限。
研究结论：自然发生的幼龄阿卡拉曼羔羊大叶性肺炎与肺细菌群落的明显重构相关，而非样本内多样性的普遍丧失。尽管两组间α多样性无显著差异，但β多样性分析显示群落组成存在显著差异，且无证据表明这些差异由不均等的多变量离散度驱动。曼海姆菌属（Mannheimia）是最一致的肺炎相关属，而丰度和患病率分析表明涉及多个细菌分类单元的更广泛变化。将16S rRNA基因分析与大体和组织病理学确认相结合，增强了这些群落水平差异在形态学确诊肺部疾病背景下的生物学解释。这些发现描述的是关联性，并未确立单个细菌分类单元的因果或致病作用。更大规模、纵向研究结合更高分辨率的分类学和功能学方法，以及相关疫苗接种和饲养管理信息，对于确定这些肺炎相关微生物模式的可重复性和临床意义至关重要。该研究发表于《Animals》期刊。
