连接了适配体并载有橄榄苦素的PLGA纳米颗粒能够增强乳腺癌细胞的凋亡作用

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Aptamer conjugated and oleuropein loaded PLGA nanoparticles increase the apoptosis of breast cancer cells

　　摘要：最新的治疗策略旨在提高癌细胞对细胞凋亡的敏感性。植物化学物质橄榄uropein（OLP）显示出良好的抗癌特性；然而，其较低的生物利用度和非特异性递送方式限制了其抗癌潜力。因此，我们开发了一种新型的适配体结合纳米载体递送系统，以实现OLP对MDA-MB231乳腺癌细胞的靶向、高效和可控递送。合成了载有橄榄uropein的纳米颗粒（OLP-NPs），并与其特异性Mucin-1适配体（APT）结合（APT-OLP-NPs），以高效递送OLP。研究表明，APT-OLP-NPs颗粒具有较小的流体力学直径和负电荷Zeta电位，这促进了细胞对OLP的有效摄取。与OLP-NPs相比，适配体结合后纳米颗粒尺寸的增加证实了表面功能化的成功。后者支持了该递送系统的靶向能力。APT-OLP-NPs显著降低了MDA-MB-231细胞的活力并诱导了细胞凋亡，这一点通过凋亡相关基因（包括Bcl-2家族成员）的mRNA表达变化得到了验证。蛋白质水平分析表明，OLP的抗癌效果是由Akt1信号通路驱动的，该通路控制NF-κB的表达并引导转录因子FOXO1调节细胞凋亡。总体而言，我们的发现表明，该递送系统能够增加侵袭性乳腺癌细胞的凋亡。

引言：癌症，特别是乳腺癌（BC），是全球诊断最多的癌症类型，也是导致女性癌症相关死亡的主要原因[1],[2]。目前的治疗策略基于分子亚型分类，包括手术、放疗、化疗、抗内分泌治疗、靶向治疗和免疫治疗[3],[4]。然而，乳腺癌的复发以及对化疗和放疗的耐药性仍然是实现最佳治疗效果的主要障碍[5],[6],[7]，这突显了新型治疗方法的必要性[8]。乳腺癌细胞中的程序性死亡往往受到抑制[9],[10]，使得治疗变得困难。近年来，植物化学物质因其在治疗多种疾病（包括癌症）方面的潜力而受到广泛关注。橄榄uropein（OLP）是一种多酚化合物，已显示出抗炎、信号传导和促凋亡活性。我们先前研究表明，OLP可以调节LPS刺激的巨噬细胞（以下简称炎症巨噬细胞模型；MMI）和癌细胞的炎症和凋亡。此外，OLP还被证实对HER2阳性及三阴性人类乳腺癌细胞（MCF-7, MDA-MB231）具有强大的抗癌效果，通过抑制细胞增殖、运动性和侵袭性[11],[12],[13],[14]。我们的最新发现还揭示了OLP的信号传导、抗炎和免疫调节活性。尽管OLP具有抗炎特性、增加细胞凋亡敏感性的能力以及调节信号通路的作用，但由于缺乏有效的递送系统，其临床应用仍受到限制。此外，由于其较低的生物利用度和在各个器官中的非特异性分布，OLP的临床应用也受到限制。基于纳米颗粒（NP）的药物递送系统可以客观解决这些问题，实现靶向和持续的药物递送。脂质-聚合物杂化纳米颗粒（LPHNPs）的发展已显示出在实验性乳腺癌动物模型中，经静脉给药后药物（如COX-2抑制剂醋氯芬酸[15]和免疫调节剂甲氨蝶呤[15]）的药代动力学和治疗效果得到改善[15]。此外，我们的团队此前还开发了pH敏感型载有多西他赛的LPHNPs，以增加实验性乳腺癌动物模型中乳腺癌细胞的凋亡并减少肿瘤负担[16]。我们还对配体锚定的LPHNPs[17]和岩藻糖锚定的固体脂质纳米颗粒[18]进行了大量研究，以实现甲氨蝶呤的有效递送。最近，我们探索了OLP的治疗活性，证实了其在MMI（LPS刺激的人类THP-1巨噬细胞）中的促氧化和抗炎特性。基于这些体外研究，我们在常规培养的无性繁殖期恶性疟原虫感染中确认了OLP的抗疟疾活性，并在P. berghei感染的小鼠模型中进一步验证了这些发现[14],[19],[20],[21]。

本研究开发了一种基于聚合物的纳米颗粒系统，使用PHBV/PLGA混合物纳米颗粒高效递送OLP。这些PHBV/PLGA NPs与特异性适配体序列结合，该适配体能够靶向MDA-MB231（三阴性乳腺癌；TNBC）细胞。我们假设这种纳米载体系统能够显著诱导乳腺癌细胞的凋亡。为了验证这一点，我们进行了多项实验以确认OLP在MMI中的免疫调节、抗炎和信号传导潜力。炎症的调节得到了实验证据的支持，证明了OLP能够诱导乳腺癌细胞（MCF-7, MDA-MB231）和卵巢肿瘤细胞（PA-1）的死亡。此外，与OLP纳米颗粒处理相关的IL-35蛋白表达增加与MCF-7和MDA-MB231细胞的凋亡增加有关[22],[23]。总体而言，从抗原刺激的人类巨噬细胞、乳腺癌细胞（MCF-7 & MDA-MB231）和人类卵巢（PA-1）肿瘤细胞获得的结果表明，OLP具有免疫调节和抗炎潜力，并能够增加乳腺癌细胞的凋亡。

章节片段：
- 纳米材料制备：聚（3-羟基丁酸-共-3-羟基戊酸）（Sigma–Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）
- 聚（乳酸-共-乙醇酸）（Sigma–Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）
- 通过PLA和PGA的聚合反应合成PLGA [24]
- 聚（3-羟基丁酸-共-3-羟基戊酸（PHBV）的结构 [25]
- 纳米颗粒制备：采用双乳液（w/o/w）溶剂蒸发法合成PLGA/PHBV混合物纳米颗粒（NPs）

- 有机相制备：将12 mg的PLGA和8 mg的适配体（APT）结合，将橄榄uropein装载到纳米颗粒中，以实现向MDA-MB231细胞的递送
- 载有橄榄uropein的PHBV/PLGA混合物纳米颗粒（OLP-NPs）通过DLS进行了表征。空白PLGA/PHBV纳米颗粒的平均流体力学直径为105 nm（图1A-I）。OLP的装载使颗粒尺寸增加到177 nm（图1A-II），随后与MUC1特异性适配体（APT）结合后，尺寸进一步增加到253 nm（图1A-III）。
- Zeta电位测量显示，空白纳米颗粒的表面电荷为-0.4 mV（图1A-IV）。OLP的装载改变了纳米颗粒的表面电荷。

讨论：先前的研究[11],[12],[46],[47],[48]为研究OLP在炎症巨噬细胞模型（MMI）中的炎症和信号传导活性提供了依据[20],[21]。我们先前已经证明了OLP在无性繁殖期恶性疟原虫培养和P. berghei感染小鼠模型中的抗炎和抗疟疾活性[19],[20],[21]。这些发现共同支持将OLP归类为“免疫调节剂”，因为它能够调节免疫系统。

结论与未来展望：我们的研究表明，OLP是一种具有双重功能的治疗候选分子，既可作为免疫调节剂，也可作为抗癌剂。OLP的促氧化特性似乎通过调节PI3K-Akt1信号通路及其下游转录因子来促进乳腺癌细胞的凋亡。适配体结合的PHBV/PLGA纳米颗粒的开发代表了一种新型的靶向递送策略。

作者贡献声明：
Hema Alajangi：方法学、实验设计、数据分析。
Kanwaljit Rana：软件支持、资源提供、方法学、数据分析。
Jatinder Kaur：方法学、实验设计。
Alka Rao：方法学、实验设计。
Geeta Rai：方法学、实验设计。
Ujjawal Sharma：方法学、实验设计、数据分析。
Reetesh Kumar：方法学、实验设计、数据分析。
Rajeev Kumar Tyagi：写作——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、项目监督、伦理批准及参与同意。
无

出版同意：不适用

利益冲突声明：作者声明不存在利益冲突。

数据可用性声明：所有数据文件已包含在 manuscript 中，可根据请求提供。此外，生成的RNA测序原始数据已存入NCBI的在线数据库。序列检索档案（SRA）编号为SUB15682705，相关访问号为PRJNA1338103。BioProject及相关SRA元数据可在https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA1338103?reviewer=cbu9rjbd9tn4rq3ubgb1hdud6（只读格式）获取。

临床试验编号：不适用

资金支持：Rajeev Tyagi感谢DBT（新德里）、Ramalingaswami Re-entry Fellowship项目（编号BT/RLF/Re-entry/2018）和印度医学研究委员会（ICMR）（新德里）的资助（35/1/2020-Nano/BMS）对本研究的慷慨支持。同时，也感谢CSIR的资助。

声明利益冲突：作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：
Rajeev Tyagi感谢DBT（新德里）、Ramalingaswami Re-entry Fellowship项目（编号BT/RLF/Re-entry/2018）和印度医学研究委员会（ICMR）（新德里）的资助。