《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Identification of Novel Diimide and Hydrazone Scaffolds for Synergistic HIV-1 Shock and Kill Strategies
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摘要联合抗逆转录病毒疗法（ART）目前是控制感染个体 HIV 复制的标准治疗方案。然而，由于该治疗主要针对病毒酶，潜伏感染储库的存在和耐药性的产生仍然是病毒清除的主要障碍。为了克服这一点，开发了一种“冲击与杀灭”方法，使用“潜伏逆转剂”（LRAs）激活潜伏前病毒（“冲击”），
摘要
联合抗逆转录病毒疗法（ART）目前是控制感染个体 HIV 复制的标准治疗方案。然而，由于该治疗主要针对病毒酶，潜伏感染储库的存在和耐药性的产生仍然是病毒清除的主要障碍。为了克服这一点，开发了一种“冲击与杀灭”方法，使用“潜伏逆转剂”（LRAs）激活潜伏前病毒（“冲击”），通过 ART 和免疫介导的清除实现病毒消除（“杀灭”）。我们之前在小分子库上对潜伏感染 HIV 的单核细胞和 CD4+ T 细胞系进行了筛选，并确定了两种新型 LRA 候选物（化合物 #C1 和 #C3）。基于其结构特征，我们现在确定了两种相关衍生物，化合物 #C2 和 #C4。化合物 #C1 和 #C2 具有二亚胺结构，而 #C3 和 #C4 具有腙结构。在 J-Lat 10.6 细胞中，所有四种化合物在与 JQ1 或 PKC 激活剂联用时，均协同增强了 LRA 活性。值得注意的是，#C4 与 JQ1 联用进一步增强了在 J-Lat 10.6 模型细胞中对单独 JQ1 反应有限的 HIV 再活化。在来自 ART 抑制个体的离体纯化 CD4+ T 细胞中，#C4 引起了统计学上显著且供者匹配的 HIV-1 转录增加（配对 t 检验，P = 0.0137，n = 8），而 JQ1 在相同的配对分析下未达到显著性，尽管平均幅度相当。值得注意的是，#C4 还额外诱导了在单独 JQ1 反应有限的供者中可测量的再活化。RNA 测序分析表明，化合物 #C4、JQ1 和 PKC 激活剂通过不同的分子机制介导了 LRA 活性。总之，这些发现阐明了一类结构新颖的 LRA 候选物，其参与了一种不同于 JQ1 和经典 PKC 信号的潜伏逆转机制，从而支持进一步调查其在旨在消除 HIV-1 储库的联合策略中的效用。
引言
联合抗逆转录病毒疗法（ART），主要靶向病毒酶，可将 HIV 感染个体的病毒载量降至检测不到的水平，是改善 HIV 感染者预后的主要治疗手段。然而，目前的 ART 无法有效靶向感染细胞中潜伏的 HIV 储库，这与耐药性的发展一起，仍然是 HIV-1 清除的重大障碍。为此，正在开发几种策略，包括使用 CRISPR 消除前病毒基因的基因疗法 [1]，增强抗 HIV 免疫反应的疫苗 [2]，以及使用广谱中和抗体的免疫疗法 [3]。除了这些策略外，“冲击与杀灭”方法利用潜伏逆转剂（LRAs）重新激活潜伏前病毒（冲击）[4]，随后通过细胞病变效应、凋亡或免疫介导的细胞毒性（CTL）反应导致宿主细胞死亡（杀灭），并与 ART 结合以防止宿主细胞再感染的发生。这一策略仍处于开发的早期阶段，但目前正在研究几种小分子化合物 5, 6, 7。这些药物包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi），如 SAHA/伏立诺他 [8]；溴结构域和卷曲结构域抑制剂（BETi），如 JQ1 [9]；以及蛋白激酶 C（PKC）激动剂，如 Prostratin、PEP-005（3-天使酸英吉利醇酯）和 Bryostatin-1 [10]。几个研究组报道，可能需要具有不同功能机制的 LRA 候选物组合，才能有效地诱导储库细胞中前病毒的再活化 11, 12, 13, 14, 15。目前再活化 HIV-1 前病毒的最佳候选方案被认为是 BRD4 抑制剂（JQ1）与 PKC 激动剂（如 Prostratin、PEP-005）的组合 12, 16, 17。然而，令人失望的是，尽管 LRAs 或其组合在离体和体外分析中显示出强效作用，但多项临床试验未能产生优于当前 ART 的治疗效果以减小潜伏储库大小 18, 19, 20, 21, 22。这可能是由于潜伏病毒储库的异质性所致，包括其大小以及整合前病毒的染色体位置 23, 24, 25, 26。虽然静息记忆 CD4+ 淋巴细胞被认为代表潜伏 HIV 的主要储库，但单核细胞/巨噬细胞也参与其建立和维持 27, 28, 29。因此，部署新的 LRAs 或其组合对于首先诱导单核细胞/巨噬细胞以及 CD4+ T 细胞中有效的前病毒再活化，从而消除 HIV 至关重要。
在这里，我们在先前建立的 THP-1NLuc #225 细胞系上筛选了小分子库，作为潜伏感染单核细胞的模型 30, 31。我们鉴定了一种名为 #C4 的化合物，该化合物在模型细胞中体外以及在患者细胞中离体均表现出长末端重复序列（LTR）介导的 HIV-1 再活化。因此，#C4 是 LRA 开发的潜在先导化合物，特别是因为它在与 J-Lat 10.6 模型细胞中的 JQ1 或 PKC 激动剂联用时表现出协同活性。通过 RNA 测序进行的转录组分析表明，化合物 #C4 可能通过一种不同于 JQ1 且可能相对于 PKC 信号通路的非经典分子机制重新激活 HIV-1 转录。这些发现支持进一步探索旨在减小目前 HIV-1 储库的 HIV-1 潜伏逆转的联合方法。
章节片段
细胞
THP-1-NanoLuc-clone#225（THP-1NLuc#225）细胞系是通过用水疱性口炎病毒 G（VSV-G）假型病毒 NLnNanoLuc-Kp 感染人类单核细胞 THP-1 细胞系构建的，如前所述 [31]。J-Lat 全长 GFP 克隆 #10.6（J-Lat 10.6 细胞）和 J-Lat LTR-Tat-IRES-GFP 克隆（J-Lat A2 细胞）来自 NIH HIV 试剂计划 [32]。这些细胞以及 THP-1 和 Jurkat 细胞系（分别为 THP-1NLuc#225 细胞和 J-Lat 10.6 细胞的亲本系）是
新 LRA 候选物的鉴定
利用 4-苯基喹啉 -8-胺（PQA）筛选策略，我们之前鉴定了小分子 LRA 候选物 #C1 和 #C3 [33]，它们能重新激活潜伏感染的 J-Lat 10.6 [32] 和 THP-1NLuc#225 细胞 30, 31 中的 HIV-1 前病毒。为了进一步研究构效关系，我们将化合物 #C2 和 #C4 设计为分别为 #C1 和 #C3 的衍生物（图 1A）。具体来说，#C2 是通过将 #C1 的酚羟基替换为二甲氨基而工程化设计的
讨论
最近报道了几种小分子可作为潜伏逆转剂（LRAs），用于重新激活潜伏感染细胞储库中的 HIV-1，从而促进其消除 [47]。CD4+ T 淋巴细胞被认为代表持续的 HIV 主要储库，而单核细胞/巨噬细胞的作用仍有争议 [48]。然而，来自体内分析的最新数据为后者作为病毒具有显著作用积累了证据
CRediT 作者贡献声明
Hirokazu Tamamura：监督，资金获取。Kenji Maeda：监督，项目管理，资金获取。Hiroaki Takeuchi：写作 – 审阅与编辑，监督，项目管理，资金获取。Chieko Fujisaki：研究。Takuya Kobayakawa：可视化，资源。Tomoya Tsukitani：研究。Hiroki Yoshino：研究。Sayaka Sukegawa：写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿，可视化，项目管理，方法论，
伦理声明
已征得所有参与者或其法定代表人参与本研究并发表文章的书面知情同意。已遵守参与者的隐私权。
本研究是在进行研究所在地的相关法律、监管框架和指导方针合规下进行的。本研究已获得鹿儿岛大学和日本健康安全研究所批准。（批准号 NCGM-S-002259-08）
数据可用性
本研究生成的 RNA 测序数据集在稿件接收时未存入公共存储库。原始 FASTQ 文件和处理后的计数/TPM 矩阵可向通讯作者（H.T.）提出合理请求后获得。支持本研究结果的所有其他数据均包含在本文及其补充信息中。
利益冲突声明
作者声明他们不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
这项工作由田中科学基金会和药效学研究基金会（SSukegawa.）资助，以及TMDU蓝鸟比赛（BBC）资助（SSukegawa）；日本医学研究与发展机构（AMED）在项目编号 JP18fk0410015、JP19fk0410015、JP20fk0410015 下资助 KMaeda 和 HTakeuchi。
Sayaka Sukegawa|Kouki Matsuda|Haruki Kitamura|Kousuke Tanimoto|Chieko Fujisaki|Takuya Kobayakawa|Tomoya Tsukitani|Hiroki Yoshino|Hirokazu Tamamura|Kenji Maeda|Hiroaki Takeuchi
东京科学技术大学分子病毒学系，113-8519，日本东京
