基于H?+CO?的产D-乳酸伍德氏醋酸杆菌与链延长德雷克氏梭菌的共培养

《Biochemical Engineering Journal》：H 2+CO 2-based co-cultivation of D-lactate-producing Acetobacterium woodii and chain-elongating Clostridium drakei

　　

H?可用性和pH值强烈影响C. drakei的生长和链延长；较高的压力和H?:CO?比率降低了A. woodii中D-乳酸的生产；按1:1比例顺序接种C. drakei实现了D-乳酸的完全转化；pH切换配置增加了己酸的生产但减少了丁酸的生成。

引言
将可再生、非化石碳源和能源转化为高价值产品的生物工艺有望支持向气候中性化学工业的转型。在此背景下，二氧化碳（CO?）和绿色氢气（H?）代表着特别有吸引力的底物。CO?是一种从工业废气中获取的丰富、低价值碳源，而H?可以通过使用可再生能源电力电解水来生产，从而作为一种清洁能源载体。因此，H?+CO?的生物利用对于循环生物经济、电力转化和电生物技术等新兴概念而言至关重要[1]、[2]、[3]。

尽管生物固碳传统上与光自养或化能自养生物相关联，但乙酸菌已作为一种高效的厌氧细菌脱颖而出。通过利用Wood-Ljungdahl途径（WLP），乙酸菌能够在严格厌氧条件下实现节能的CO?转化[4]、[5]、[6]。虽然目前的气体发酵研究主要集中在乙酸或乙醇生产[7]，但将自养碳通量重新导向更具还原性的高价值化合物仍是一项重大挑战。一种扩展其产品谱系的有前景的策略是通过逆向β-氧化进行微生物链延长，这能够实现短链底物向例如丁酸或中链脂肪酸（MCFAs）如己酸和辛酸等的转化[8]、[9]、[10]。然而，传统的链延长过程主要依赖于DL-乳酸或乙醇等有机电子供体，这些电子供体必须从生物质中提取，从而限制了整体的可持续性[11]、[12]、[13]。

自养链延长最近才作为可持续的替代方案受到关注，因为它能够利用CO?或CO进行固碳。基于C?的延长产物生成已在几种厌氧微生物中得到证实，包括Clostridium carboxidivorans、Eubacterium callanderi和Clostridium luticellarii[14]、[15]、[16]。然而，微生物菌群提供了另一种将CO?固定和链延长跨越不同微生物进行结合的方法。因此，大多数基于气体的链延长方法依赖于微生物菌群，其中CO?固定和逆向β-氧化由不同的微生物完成。这些菌群通常涉及一组微生物将CO和H?+CO?转化为还原性中间体，随后由第二组微生物进行延长[17]、[18]、[19]。相应的接种物通常来源于污水处理厂的厌氧污泥，代表了稳健的适应性系统，能够承受pH、温度和气体组成的变化[18]、[20]、[21]。

此外，合成菌群被引入以减少不希望的反应的可能性并维持特定菌株相互作用的优势，这是建立在开放培养过程获得的知识基础上的[18]、[22]。这些合成共培养物通常包括C?碳转化乙酸菌，如C. carboxidivorans[23]、[24]、Clostridium autoethanogenum[25]、Acetobacterium wieringae JM[26]或Acetobacterium woodii[27]，以及链延长细菌，如Clostridium kluyveri[23]、[25]、[26]或Clostridium drakei[27]、[28]。

A. woodii已被证明是基因可操作的[29]、[30]且高效的气体转化模式生物[31]。其以非常高的气体摄取速率同化H?+CO?的能力证明了强大的WLP活性，并解释了自然产生大量乙酸盐的原因[32]、[33]。代谢工程已实现了几种非天然产品的生产[34]、[35]、[36]、[37]，包括D-乳酸[38]、[39]。D-乳酸生产的一种方法包括表达D-乳酸脱氢酶（LDHD）并结合敲除天然乳酸脱氢酶复合体[38]。最近，额外表达丙酮酸甲酸裂解酶以增加到丙酮酸的可用性，从而可能提高D-乳酸的生产[40]。通过表达PFL，WLP的首个和末端中间体——甲酸和乙酰-CoA被转化为丙酮酸，这随后有可能提高D-乳酸的生产。在连续供气的控制式搅拌罐反应器（STRs）中，表达LDHD和PFL的A. woodii PlctA_LDHD_PackA-theo-PFL菌株相比仅表达LDHD的菌株，D-乳酸生产提高了45%[40]。相比之下，基于PbgaL的表达LDHD和PFL的菌株在血清瓶培养中积累了更多甲酸，产生了较少的D-乳酸，但保留了外部控制LDHD诱导的优势[40]。

通过自养批式过程获得的D-乳酸浓度在不同研究之间存在很大差异，最可能的原因是培养系统（控制式STR或简单的厌氧瓶培养）、添加H?量的差异以及培养基中酵母膏含量的不同[27]、[38]、[41]。使用A. woodii PbgaL_LDHD，D-乳酸浓度范围为0.5 g L?1（在厌氧瓶培养中）[38]到8 g L?1（在含有6 g L?1酵母膏的复杂培养基中使用连续供气的STR中）[27]。

几种细菌能够通过链延长生产己酸，但仅有少数已分离的菌株被描述为利用乳酸进行此目的[42]、[43]、[44]。其中，C. drakei代表了与基于H?+CO?的气体发酵进行整合的合适候选者。此外，C. drakei能够在与已建立的A. woodii培养条件兼容的温度和pH条件下培养。先前的研究已经证明了A. woodii和C. drakei成功共培养，表明两种生物在共同培养条件下具有兼容性[27]、[28]。C. drakei可以通过WLP自养生长，消耗H?+CO?或CO+CO?[43]。最近在血清瓶和STR中进行的研究表明，虽然使用H?+CO?的自养生长是可能的，但其速度缓慢且受能量限制，主要产生乙酸盐。补充DL-乳酸显著提高了生长速率并实现了丁酸和己酸的生产[28]。这种效果被归因于DL-乳酸作为氧化还原活性底物的作用，它通过提供还原力并实现混合营养生长期间的氧化还原平衡来支持链延长[28]、[41]。在STR中使用C. drakei SL1T进行的异养批式研究从10.7 g L?1 DL-乳酸中实现了3.14 g L?1丁酸和1.56 g L?1己酸的生产[28]。

虽然A. woodii和C. drakei都可以各自在为其单个生长和生产需求优化的条件下进行单培养，但它们在单个STR中的共培养需要共享一个操作窗口。迄今为止，关于该共培养STR培养的批式研究仅包括使用一体化（AiO）电极以实现在6 g L?1高酵母膏补充条件下添加少量H?。这些分别导致在最大OD600为1.48和0.98时产生0.08 g L?1[41]或0.11 g L?1己酸[27]。在两项研究中，A. woodii PbgaL_LDHD在工艺运行15-20小时后被诱导，C. drakei SL1T在约43小时后被添加。然而，由于A. woodii快速消耗H?[33]，持续维持H?饱和条件是允许该细菌充分发挥其自养能力的关键要求。A. woodii PbgaL_LDHD的单培养在增加的气体流速下显示出显著增加的D-乳酸浓度[27]。因此，提供适量的H?可能允许在STR中为C. drakei的下游链延长提供稳健的乳酸供给。

在连续高含H?气体供应下，生产D-乳酸的A. woodii与C. drakei的成功共培养需要对两种细菌的单培养过程中相关共培养变量进行系统的、自下而上的评估。总体而言，C. drakei在连续H?+CO?供应下的生理学特征仍然了解不足，特别是H?可用性和pH对D-乳酸利用和链延长的影响。这使得难以定义适合其与生产D-乳酸的A. woodii整合的条件。

此外，连续供气显著影响无机碳的可用性（CO?、HCO??）和细胞能量代谢，特别是对于依赖离子的微生物如乙酸菌。对于C. kluyveri而言，在培养过程中调控CO?可用性已被证明是一个强影响因素[45]。这引发了一个问题：在pH 7.0的标准A. woodii培养是否适合C. drakei SL1T的（共）培养，因为pH降低会导致更高的溶解CO?水平。此外，C. drakei SL1 T在血清瓶中的生长报告了5.4-7.5的广泛pH范围[43]，而研究更深入的基因相似的C. carboxidivorans通常在溶剂生成期间在pH 6.0下进行培养[14]、[46]。这些观察结果表明，适度降低pH可能为C. drakei提供有利条件，同时为A. woodii维持接近中性的环境。在pH 6.5下应该能够产生丁酸和己酸[14]、[47]。

与C. drakei相比，A. woodii在连续供气的控制式STR中得到了更广泛的研究，产生了定义明确且合适的培养条件[27]、[32]、[33]、[48]。为了在表达PFL的菌株中实现甲酸向丙酮酸的转化，需要充足的甲酸供应。之前对A. woodii野生株的研究表明，通过提高总培养压力和/或增加H?+CO?比率，甲酸的产生会增加，代价是生物质和乙酸的生成减少[49]、[50]。

最后，生产D-乳酸的A. woodii与链延长C. drakei的共培养研究已在没有连续气体供应[28]或原位产生H?的条件下进行[27]、[41]。在这两种情况下，H?的提供量都远低于A. woodii的最佳速率[51]。这一限制很可能制约了自养气体转化，从而限制了链延长所需还原性中间体如D-乳酸的供应。

在本研究中，我们调查了在连续气体供应下H?可用性和pH如何影响C. drakei的生长、D-乳酸利用和链延长。同时，评估了工艺条件对工程化A. woodii D-乳酸生产的影响。基于这些单培养结果，随后将两种生物体在连续H?+CO?供应下进行结合，以研究合成H?+CO?基共培养中D-乳酸介导的链延长。图1展示了工程化A. woodii与C. drakei之间代谢相互作用的简化概述。

分段摘要
菌株和培养基
A. woodii PbgaL_LDHD_PackA-theo_PFL在乌尔姆大学构建并在本研究中供使用。所有遗传修饰均基于A. woodii ΔpyrE菌株[30]、[52]。在生产乳酸的A. woodii菌株中，编码A. woodii天然分叉LDH/EtfAB复合体的基因被删除，产生了A. woodii ΔpyrE ΔlctBCD。此外，来自L. mesenteroides的LDHD被引入到可被乳糖诱导的启动子系统PbgaL控制下，产生了菌株A。

在有无H?供气的情况下C. drakei SL1T的批式培养
为了预期C. drakei SL1T在共培养中的表现，首先在定义的混合营养条件下进行了单培养。实验在pH 6.5和pH 7.0下、有无H?补充的情况下进行，使用DL-乳酸（4.5 g L?1）作为主要有机碳源（图2）。

在pH 7.0且无H?补充的批式过程中，在培养的第一小时内观察到培养基的严重变黑。假设变黑可能是由于……

结论
本研究展示了一种气体驱动的共培养，其中工程化A. woodii在控制且可扩展的搅拌罐生物反应器中以连续H?+CO?供应向C. drakei提供D-乳酸用于链延长。C. drakei的单培养揭示了其对H?可用性和pH的代谢适应。测试了增强甲酸生产、从而提高工程化A. woodii单培养中D-乳酸浓度的策略。然而，培养压力和H?:CO?比率的增加……

CRediT作者贡献声明
Sebastian Reutter：调查、数据整理。Diego Schneider：调查、数据整理。Anna Stock：撰写——初稿、可视化、验证、方法学、调查、形式分析、数据整理、概念化。Kira S. Baur：撰写——审阅与编辑、验证、方法学、调查、数据整理。Simon Wübbe：调查、数据整理。Frank R. Bengelsdorf：撰写——审阅与编辑、验证、监督、项目管理、方法学。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能会影响本研究中报告的工作。

致谢
作者感谢德国研究基金会（DFG）在优先计划2170'InterZell'框架内资助联合研究项目CaproSyn（WE 2715/20-2和BE 7028/1-2）。感谢TUM研究生院对Anna Stock的支持。

利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。

Anna Stock | Kira S. Baur | Sebastian Reutter | Diego Schneider | Simon Wübbe | Frank R. Bengelsdorf | Dirk Weuster-Botz