利用Mn X射线吸收光谱及XFEL晶体学见解研究光系统II中的高自旋S2态

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics》：Investigation of the high-spin S 2 states in photosystem II using Mn X-ray absorption spectroscopy with insights from XFEL crystallography

　　

光合作用中的水氧化通过一个四电子氧化还原反应发生，该反应由光系统II（PS II）中的氧释放复合物（OEC）催化，OEC由Mn₄CaO₅簇组成。在水氧化反应的四个稳定中间态中，据文献报道，具有Mn(III)Mn(IV)₃形式氧化态的顺磁性S₂态具有多种自旋状态，包括高自旋（HS，5/2，g≥4.1）和低自旋（LS，1/2，g=2）形式。先前的计算研究提出这两种形式的结构不同，高自旋形式可能代表OEC在S₂到S₃转变过程中的中间形态，该步骤是第一个底物水结合到簇的最后一个开放配位位点的阶段。在本研究中，研究人员利用Mn K边扩展X射线吸收精细结构（EXAFS）和X射线吸收近边谱（XANES）研究了T. vestitus PS II的pH诱导HS-S₂态。在HS和LS S₂态的EXAFS和XANES之间观察到微小但显著的差异。EXAFS数据和拟合结果表明，这两种状态下簇的基本几何结构保持不变。因此，研究人员假设HS和LS S₂态之间的差异可能源于化学差异，例如氧桥和/或水配体或其周围环境的不同质子化状态。研究人员还检查了基于XFEL的室温晶体结构中S₂态的详细氧原子位置，并确认在中性pH室温条件下，该结构与具有开放类立方烷几何构型的LS-S₂模型一致。

论文解读：光系统II高自旋S₂态的结构本质——XAS与XFEL晶体学的联合视角

光合水氧化是维持地球好氧生命的关键反应，由光系统II（PSII）中的氧释放复合物（OEC）催化。OEC是一个由四个锰离子和一个钙离子通过氧桥连接而成的金属簇（Mn₄CaO₅），在Kok循环中依次经历S₀至S₄五个氧化还原态，最终将两分子水氧化为氧气。在四个稳定中间态中，S₂态因其顺磁性而受到广泛关注。电子顺磁共振（EPR）研究早已揭示S₂态存在两种自旋异构体：以g=2多线信号为特征的低自旋（LS，Stotal=1/2）形式，以及以g≥4.1信号为特征的高自旋（HS，Stotal=5/2或更高）形式。理论化学研究对HS-S₂的结构提出了多种模型，包括封闭类立方烷结构、水（或羟基）早期插入Mn1开放配位位点的结构，以及蛋白质微环境质子化状态改变的结构。然而，这些模型缺乏直接的实验验证。由于HS-S₂在菠菜和蓝藻中的EPR信号特征（g=4.1与g=4.9）不同，且产生条件各异，其真实结构和催化相关性长期存在争议。为了阐明HS-S₂态的结构本质，研究人员选择嗜热蓝藻T. vestitus为研究对象，利用Mn K边X射线吸收光谱（XAS）系统比较了不同pH条件下制备的LS和HS-S₂态，并结合室温XFEL晶体学数据对S₂态中O5桥氧的位置进行了细致检验。

研究人员首先通过EPR光谱确认了样品状态。在pH 6.5条件下，200 K光照生成的LS-S₂态呈现典型的g=2多线信号；在pH 8.6条件下，光照后经室温退火30秒，约80%的LS中心转化为g=4.9的HS-S₂态。EPR对照实验表明，pH 6.5样品退火后仅观察到多线信号的减弱而无HS信号生成，说明LS向HS的转变依赖于碱性pH条件。在此基础上，研究人员采集了Mn K边XANES和EXAFS数据，并将结果与室温XFEL晶体结构（PDB ID 6DHF）进行了拟合对比。针对S₂态晶体结构，研究人员重新处理了XFEL衍射数据，通过O5缺失图、一维电子密度迹线以及双构象占据率精修等多种方法检验了封闭类立方烷构型存在的可能性。这些晶体学分析一致表明，在2.02 ?分辨率的室温S₂态电子密度图中，O5仅有一个明确位置，不存在指向Mn1的第二密度峰；将OEC分裂为开放与封闭两种构象进行精修时，封闭构型的占据率约为10%，与S₁对照态的噪声水平相当。因此，室温中性pH下S₂态的稳定结构为开放类立方烷构型，与LS模型一致。

Mn XANES结果显示，S₁态在pH 8.6下的边缘能量比pH 6.5高约0.3 eV，但两种pH下LS-S₂态的边缘位置完全一致；当LS-S₂在碱性pH下退火转化为HS-S₂态后，边缘进一步向高能方向移动0.3 eV。XANES一阶导数及前边峰分析还发现HS-S₂的第一个前边峰强度略高于LS-S₂态。EXAFS光谱比较显示，S₁态两种pH之间的差异主要体现在德拜-沃勒因子的减小，即pH升高使Mn-O和双μ-氧桥Mn-Mn距离分布更均匀；HS-S₂相对于LS-S₂态的第二傅里叶变换峰（对应双μ-氧桥Mn-Mn散射）明显变窄并向短距离方向位移，但光谱总体特征仍与S₁和LS-S₂态相似，与S₃态的结构变化幅度相比要小得多。EXAFS拟合进一步表明，S₁和S₂各状态的核心Mn-Mn、Mn-Ca距离均与开放类立方烷模型相符；从LS-S₂到HS-S₂，Mn-O距离从1.84 ?伸长至1.85 ?，双μ-氧桥Mn-Mn距离从2.71 ?伸长至2.75 ?，但这些距离变化远小于S₂到S₃转变中Mn1开放位点结合新氧配体后产生的0.4 ?级位移。值得注意的是，HS-S₂的EXAFS光谱与S₃态差异明显，排除了HS-S₂中已经发生水或羟基结合到Mn1位点的可能性。

讨论部分综合了物种差异和pH效应的证据。菠菜PS II与T. vestitus PS II产生HS-S₂的条件和g值不同，菠菜g=4.1态在退火时转化为g=2 MLS态，而T. vestitus的g=4.9态在退火时增强，表明两者是化学性质不同的状态。XANES边缘位移的方向也相反：菠菜HS-S₂较LS向低能移动，而T. vestitus HS-S₂较LS向高能移动。基于S₁pH8.6边缘高于S₁pH6.5，且与LS-S₂边缘位置接近的现象，研究人员推测碱性pH可能使OEC在S₁态时已处于类似S₂态的质子化构型，从而在S₁到S₂的氧化过程中解耦了电子与质子的协同移动。对于HS-S₂的结构，研究人员明确提出：EXAFS数据不支持封闭类立方烷模型，因为该模型预期会显著增加μ-氧桥Mn-Mn距离的异质性并降低第二FT峰强度，而实验观察与此相反；同样不支持早期水插入模型，因为S₃态特征的几何变化幅度远大于本研究中HS与LS的差异。最可能的情况是OEC周围质子化状态的改变，例如桥氧（O3、O4、O5）、W1/W2配体或其氢键网络中的去质子化事件，导致锰中心的净正电荷密度升高，进而引发自旋基态的改变。

结论部分可概括为：通过提高pH在T. vestitus PS II中产生HS S₂（g=4.9）态，研究人员利用Mn K边XAS揭示了该高自旋物种的化学与结构特征。基于LS g=2与HS g=4.9态EXAFS谱的总体相似性，研究人员认为OEC或其周围微环境质子化状态的差异是解释两种自旋异构体最合理的模型。pH诱导的HS-S₂态XAS数据未显示封闭类立方烷或S₃样结构重排的证据；室温XFEL晶体学数据同样表明S₂态Mn₄CaO₅复合物采用开放类立方烷构型，与LS-S₂模型完全一致，且无法检测到封闭类立方烷的O5位置。这些结果强化了封闭类立方烷构型不构成中性pH条件下可稳定观测的S₂结构的观点，但不排除其作为瞬态或特定条件状态发挥作用的可能性。该研究为理解S₂态自旋异构体的结构基础提供了关键的实验约束，对阐明OEC在S₂到S₃转变中底物水结合与质子转移的分子机制具有重要意义。