大鼠实验性牙外伤后根尖骨组织中 RANK/RANKL/OPG 信号轴的创伤特异性及时间依赖性变化

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》：Trauma-specific and time-dependent changes of the RANK/RANKL/OPG signaling axis in the periapical bone tissue after experimental traumatic dental injuries in rats

　　

摘要 RANK（NF-κB受体活化因子）/RANKL（RANK配体）/OPG（护骨素）系统调控破骨细胞的分化、活性和存活，以及炎症/免疫反应，提示其在创伤性牙损伤（TDIs）愈合过程中可能发挥作用。本研究旨在描述大鼠模型中TDIs发生后根尖骨组织中RANK/RANKL/OPG轴的分子表达动态。在SD大鼠（n = 18）的左上颌第一磨牙上模拟三种TDIs：牙齿脱位（TA）；侧方移位（LL）；复杂性冠折（CCF）。在损伤后第3、14和28天，通过Western blot检测根尖骨组织中目标蛋白水平（每个时间点亚组n = 6）。TA和LL后，RANK含量在愈合过程中未见显著变化，而OPG水平逐渐下降。然而，这两种损伤的RANKL表达动态存在明显差异：在TA中，RANKL迅速升高，在第14天达到峰值，到第28天时几乎恢复正常对照水平；在LL中，RANKL逐渐升高，在第28天达到峰值。CCF表现出独特的、非线性的RANK波动模式：第3天迅速升高，第14天显著下降，第28天中等升高。OPG在第14天达到最低值，随后在第28天回升。最后，膜结合型和可溶性RANKL水平在CCF后第3天升高，随后下降。观察到的根尖骨组织中RANK/RANKL/OPG蛋白表达动态具有创伤特异性和时间依赖性，提示不同类型的TDIs与不同的分子重塑相关转变有关，尚待功能验证。

引言 创伤性牙损伤（TDIs）是一个全球性的紧迫公共卫生问题，无论儿童还是成人患者均受其影响[1]。特别是，三分之一乳牙儿童和五分之一恒牙成人遭受TDIs[2]。研究还表明，85%口腔区域损伤的患者因牙齿创伤就诊牙医，提示TDIs发生率很高[3]。在TDIs中，最常见的是牙齿骨折、脱位和移位[4]。

迄今为止，应高度重视创伤后牙齿并发症的发生。其中最常见的是与脱位相关的融合性牙根吸收[5]、炎症性牙根吸收和牙髓坏死[6]。缺乏预测创伤后病程的可靠数据和方法以及频繁的TDIs并发症都是亟需引起重视的问题。因此，了解介导创伤性牙齿损伤区域细胞事件的潜在分子机制至关重要，以便充分评估TDIs愈合的动态过程并选择最有效的治疗策略。

为了有效管理TDIs并改善预后，多学科方法治疗受创牙齿，并深入了解相邻骨组织中骨重塑和创伤相关炎症过程的研究，仍然是广泛关注的焦点。骨重塑不仅可以在生理背景下考虑，也可以在病理背景下考虑。在TDIs下，根据创伤类型不同，可能触发炎症相关的病理性骨重塑，特别是当受损牙齿周围骨组织中成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的精密平衡向过度吸收方向偏移时。反过来，骨吸收是牙周炎、骨质疏松症和关节炎等慢性炎症性骨病的主要病理因素。

最新研究发现，细胞因子系统参与正常和病理骨代谢[7]。特别应关注受体-配体系统RANK（核因子κB受体活化因子）/RANKL（RANK配体）/OPG（护骨素）。RANK/RANKL/OPG系统具有广泛的特异性功能，取决于这些组分表达的组织和细胞类型。它可能调节骨骼稳态、骨重塑、免疫、炎症、血管钙化甚至癌症进程[8]。反过来，RANK/RANKL/OPG系统的失调被公认为是继发性骨质疏松症发展的核心致病机制。RANKL表达增加伴OPG产生减少使RANKL/OPG比率偏移，驱动破骨细胞介导的骨吸收超过成骨细胞骨形成的能力[9]。这种失衡由多种因素触发，如雌激素缺乏、慢性炎症、衰老和糖皮质激素过多，导致骨矿物质密度进行性丧失和骨折风险增加[10]。

然而，除了其在骨重塑中的系统性作用外，RANK/RANKL/OPG细胞因子轴在口腔及其相关结构中发挥多样且多方面的作用。特别地，这些蛋白调节牙齿萌出[11]、牙根吸收和牙本质破骨细胞形成[12]，在牙源性囊肿的囊性扩展中发挥作用[13]，并可作为人类口腔鳞状细胞癌侵犯颌骨的生物标志物[14]。此外，RANK/RANKL/OPG通路的组成部分不仅被认为是全身代谢调节因子，还可能以自分泌/旁分泌方式发挥作用的蛋白，这对于TDIs愈合动态过程中炎症过程的局部细胞因子调节可能具有重要意义。

RANK由造血破骨细胞前体、成熟破骨细胞、软骨细胞、巨噬细胞、树突状细胞和其他细胞类型以跨膜异三聚体受体的形式表达[15]。其配体RANKL是一种II型同源三聚体跨膜蛋白，可以以两种分子量不同的形式存在：膜结合型（mRANKL，35–40 kDa）和因蛋白水解切割从膜上释放的可溶性蛋白衍生物（sRANKL，20 kDa）。它由成骨细胞和骨细胞等成骨细胞[16]以及包括骨髓基质细胞、CD4? T细胞、巨噬细胞、活化的树突状细胞和T淋巴细胞在内的其他细胞类型表达[17]。在牙组织中，RANKL由包括牙本质细胞、牙髓细胞、牙周成纤维细胞和牙本质破骨细胞在内的多种细胞释放[12]、[18]、[19]。RANK配体在骨微环境中改变细胞行为，包括在正常和疾病状态下对成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞和淋巴细胞的影响[20]。细胞因子轴的第三个成员OPG缺乏跨膜结构域，作为RANKL的诱饵受体发挥作用，负向调节破骨细胞生成并可能对抗骨破坏[21]。OPG存在于许多组织中，包括心脏、骨髓、脾脏、肝脏和肾脏。在口腔中，OPG被认为是牙周膜功能稳态控制的关键因子[22]，也是保护牙骨质免受牙根吸收的保护因素[23]。

牙组织中的骨吸收细胞活化频率低于骨骼骨，主要与乳牙脱落、龋病、创伤和正畸移动相关的炎症过程触发[12]。由于RANK/RANKL/OPG三联体负责破骨细胞分化、活性和存活，以及炎症/免疫反应的调节，我们提出RANK/RANKL/OPG轴可能在TDIs愈合过程中发挥关键作用，通过决定是否触发创伤相关病理性吸收及程度如何。特别地，RANKL与RANK直接相互作用导致核转录因子κ-B（NF-κB）活化，NF-κB在炎症过程中也发挥关键作用[24]，包括牙齿创伤。迄今为止，关于不同类型TDIs后RANK/RANKL/OPG系统状态的实验数据缺乏，尤其是关于其恢复动态的数据。因此，本研究旨在评估大鼠实验性创伤性牙损伤后根尖骨组织中RANK/RANKL/OPG轴的动力学变化。为实现主要目标，我们模拟了三种最常见的TDIs：牙齿脱位（TA）、侧方移位（LL）和复杂性冠折（CCF），并直观记录恢复过程的动态变化，检测大鼠根尖骨组织中RANK/RANKL/OPG系统组分的蛋白含量。

段落摘要

动物及创伤性牙损伤建模 由于大鼠牙周组织及其解剖结构与人类相似，本实验使用Wistar大鼠。8周龄雄性Wistar大鼠（110.5 ± 5.0 g）饲养于博格丹诺夫国立医科大学动物实验设施，12小时光照/黑暗周期（+24.0 ± 2.0°C，65.0 ± 5.0%湿度），自由获取标准啮齿动物饮食和饮用水。本动物研究方案按照动物实验最佳报告规范撰写。

实验性创伤性牙损伤后愈合进程的视觉评估 实验开始时，雄性Wistar大鼠的平均基线特征如下：年龄——8周，体重——110.5 ± 5.0 g。动物实验和安乐死过程中未发生不良事件。为直观呈现不同类型实验性创伤性牙损伤的愈合过程，在TDIs后第3、14和28天对左上颌第一磨牙状态进行拍照记录（图2）。脱位后第3天（图2A），牙齿处于……

研究变量的讨论 TDIs延迟或不充分治疗可能恶化预后并导致炎症相关牙根吸收，特别是在移位的牙齿中[30]，以及融合性牙根吸收、牙髓坏死和牙髓根管钙化[6]。随着治疗概念和牙科临床实践的不断发展，阐明驱动和控制骨吸收的分子过程并表征不同类型TDIs愈合后独特的分子表达模式仍然……

结论 总之，本研究提供了关于不同类型TDIs——脱位、侧方移位和复杂性冠折——愈合过程中RANK/RANKL/OPG信号三联体时间表达动态的新见解。通过比较不同TDIs实验动物模型中三个恢复时间点的RANK、RANKL、OPG蛋白表达动态，我们证明RANK/RANKL/OPG表达动力学具有创伤特异性且……

作者贡献声明 Emir Chehertma：初稿撰写、软件、资源、方法论、调查研究。Oleksandr Savychuk：审阅与编辑、指导、项目管理、资助获取、形式分析、概念化。Nataliia Bidenko：审阅与编辑、指导、项目管理、资助获取、概念化。Larysa Natrus：审阅与编辑、验证、软件、资源、方法论、数据管理。Olha Lisakovska：初稿撰写。

伦理声明 本动物实验方案经博格丹诺夫国立医科大学生物伦理委员会批准（协议编号153，2021年11月29日）。

资助 本研究未获得公共、商业或非营利机构的任何专门资助。

利益冲突声明 作者声明不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢 我们衷心感谢Volodymyr Likhodiievskyi博士（博格丹诺夫国立医科大学，乌克兰基辅）在实验动物方面的协助，以及Oleksandr Liutikov博士（博格丹诺夫国立医科大学儿童预防牙科系，乌克兰基辅）在实验总体方案规划和创伤性牙损伤建模方面的咨询。

Emir Chehertma | Oleksandr Savychuk | Nataliia Bidenko | Larysa Natrus | Olha Lisakovska 博格丹诺夫国立医科大学儿童预防牙科系，乌克兰基辅，03680，Zologichna街1号