明亮的近红外二区荧光脂质膜探针用于标记生物模拟纳米囊泡，实现影像引导的靶向近红外二区温和光热-免疫治疗原位胶质母细胞瘤

《Biomaterials》：Bright NIR-II Fluorescence Lipid Membrane Probes for Labelling of Biomimetic Nanovesicles with Image-Guided Targeted NIR-II Mild Photothermal-Immunotherapy of Orthotopic Glioblastoma

　　

摘要

细胞衍生纳米囊泡具有跨越血脑屏障（BBB）和调节免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的能力；然而，缺乏高效的标记探针限制了其在追踪生物分布和实现胶质母细胞瘤（GBM）协同诊疗中的应用。在此，我们报道了由脂质体（L）和活化自体T细胞来源的细胞外囊泡（TV）组成的纳米囊泡（CL1-L-TV），采用明亮的近红外-Ⅱ区荧光膜探针（CL1）进行标记，用于胶质母细胞瘤的图像引导近红外-Ⅱ区温和光热免疫治疗。通过脂质偶联，CL1深度嵌入L-TV双层膜中，在物理上避免了聚集导致猝灭（ACQ），并通过模拟证实实现了显著增强的近红外-Ⅱ区荧光量子产率（QY = 5.98%），同时具有高光热转换效率（PCE = 69.1%）。TV表面过表达的T细胞受体和PD-1分别与GBM细胞上的主要组织相容性复合体（MHC）和PD-L1介导相互作用，有效促进BBB跨越、GBM靶向和免疫检查点阻断（ICB）。此外，CL1-L-TV能够通过成像精确定位GBM，报告肿瘤分子微环境，介导光热免疫治疗以局部消融原发肿瘤，诱导免疫原性细胞死亡，释放肿瘤损伤相关抗原，促进树突状细胞（DC）成熟，重新激活细胞毒性T淋巴细胞浸润，并引发远隔抗肿瘤效应，这些均通过基因表达分析得到验证。本研究突出了近红外-Ⅱ区荧光脂质探针在纳米囊泡标记和图像引导光热-免疫治疗中的潜力。

引言

如今，胶质母细胞瘤（GBM）仍然是最恶性的癌症之一^{1, 2, 3, 4}，确诊患者即使在接受标准手术切除后结合放疗和化疗，预后仍然较差，中位总生存期短于2年^{1, 2, 3, 4}。免疫治疗，如免疫检查点阻断（ICB）疗法，通过激活固有免疫和适应性免疫反应，特别是与其他治疗方式（化疗、放疗等）联合使用时，在黑色素瘤和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中显示出显著的临床疗效^{5, 6, 7, 8, 9, 10}。虽然免疫治疗在理论上对GBM治疗很有前景，但在实践中往往效果欠佳^{11, 12, 13, 14, 15, 16}。值得注意的是，无论是常规治疗还是免疫治疗单独使用都无法完全根除GBM，这主要是由于 formidable 障碍，如血脑屏障（BBB）紧密的内皮连接、广泛的肿瘤异质性、内在的免疫抑制性肿瘤微环境（TME）、治疗耐药性以及高度侵袭性、浸润性和转移性生长特征，这些因素共同导致复发、治疗耐药和总生存期不佳^{11, 12, 13, 14, 15, 16}。

近期，具有脂质双层结构（LBS）的细胞膜衍生纳米囊泡（CMNVs）（例如，细胞纳米囊泡¹⁷、细胞外囊泡^{18, 19, 20}、外泌体²¹、杂合纳米囊泡^{22, 23}，甚至活细胞^{24, 25}）在多种癌症（包括GBM）的诊断和治疗中作为疫苗和药物载体已显示出显著的疗效^{17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26}。这主要是因为（i）它们携带来自来源细胞的全长抗体、受体或配体，从而继承了相关的生物功能，如生物相容性、BBB渗透、GBM靶向和免疫治疗功能；以及（ii）它们的表面可以通过各种物理、化学或生物方法进行放大生物功能修饰，而其内部可以装载亲水性和疏水性药物^{17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26}。值得注意的是，具有良好生理稳定性的合成脂质体与CMNVs共享相似的LBS，可以轻易且均匀地融合在一起，生成具有优化药学和生物功能的杂合囊泡，以增强癌症成像和治疗^{23, 27, 28}。

为了监测和评估CMNVs在体内的实时分布，特别是追踪其靶向能力，近红外-Ⅱ区荧光成像（900-1700 nm）代表了一种先进的临床荧光成像技术，发挥着关键作用^{29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39}，这得益于其相比可见光（400-700 nm）和近红外-Ⅰ区（700-900 nm）具有增强的空间精度、增加的成像深度和更优的信背比（S/B）^{40, 41, 42, 43}。同时，近红外-Ⅱ区发射荧光团也被用于光热治疗（PTT），其具有轻微的脱靶侵袭性优势和高度可调的时空控制，因此对GBM治疗很有前景^{44, 45}。为了保留具有柔软且柔性LBS的CMNVs固有的物理化学和生物功能，近红外-Ⅱ区荧光膜探针（MPs）被用于嵌入LBS，而不是将固体成像纳米材料封装其中^{36, 37, 38, 39}。例如，我们之前设计了两亲性阳离子近红外-Ⅱ区荧光MPs（BMP1-2）来标记由细胞囊泡和细菌外膜组成的杂合CMNVs，实现了明亮的追踪性能³⁶。然而，BMP的阳离子电荷使CMNVs的Zeta电位偏向较不阴性的值，可能损害其长期生物功能。为解决这些局限性，合成了带有烷基链修饰的中性菁染料MPs（例如，ICR18和NIR-C₁₂），甚至AIE结构共轭（例如，C₁₂-TPAE），但它们在CMNVs中表现出较低的荧光量子产率（QY <1.56%）^{37, 38, 39}，这是由于它们的疏水性导致ACQ。值得注意的是，研究人员证明带有脂质共轭的脂质膜探针（LMPs）可以高效地标记CMNVs甚至细胞，具有高度亮度^{46, 47, 48, 49}，因为脂质部分通过强纠缠促进与LBS的容易且均匀融合。因此，具有明亮近红外-Ⅱ区荧光的近红外-Ⅱ区发射LMPs有望为CMNVs的体内追踪提供显著改进的成像保真度，相比传统LMPs，尽管相关研究仍然稀少。

在来自不同细胞的纳米囊泡中，T细胞来源的纳米囊泡（TVs）保留了T细胞膜相关的细胞毒性蛋白，如PD-1和T细胞受体（TCR）复合物，使它们成为GBM成像和治疗的天然适用纳米平台^{50, 51, 52}，尽管表面膜蛋白密度相对较低。为增强TVs在GBM治疗中的疗效，生物活化从GBM组织中提取的自体细胞毒性CD8⁺T细胞、增殖它们并赋予这些细胞大大丰富的表面PD-1和TCR以改善BBB渗透、靶向和PD-1/PD-L1免疫调节功能是有利的，这可以用来产生活化的自体TVs^{50, 51, 52, 53}。此外，温和PTT，特别是1064 nm温和PTT，比传统808 nm PTT更受GBM治疗青睐，因为具有更深的渗透和减少的脱靶效应，尽管PTT疗效和相关免疫反应仍然相对较低^{37, 39, 54, 55, 56}。鉴于GBM治疗的挑战和活化TV基治疗中近红外-Ⅱ区荧光MPs的显著潜力，在本研究中我们设计并合成了一种近红外-Ⅱ区荧光LMP（CL1）来标记由脂质体和TVs组成的杂合CMNVs（L-TV），用于近红外-Ⅱ区荧光诊断、TME分子成像⁵⁷以及图像引导的同种GBM温和近红外-Ⅱ区光热-免疫治疗（方案1）。我们从CL1的设计和合成开始，随后通过膜融合方法^{37, 38}制备CL1标记的L-TV，称为CL1-L-TV。在使用实验和计算建模表征系统评估CL1的膜融合性能后，对其体外和体内生物性能进行了评估。值得注意的是，CL1-L-TV促进了GBM的近红外-Ⅱ区荧光诊断以及原位和远隔区域的图像引导光热免疫治疗，辅以基因表达实验阐明潜在的细胞毒性机制。

章节片段

CL1和CL1-L-TV的合成与表征

将脂质部分与菁染料骨架共价共轭的CL1设计用于实现探针在LBS中的容易且均匀分布，并促进探针与LBS之间脂质组分的强纠缠，从而导致探针在CMNVs中具有高的近红外-Ⅱ区亮度。向CL1的合成路线在支持信息的方案S1中说明。简要而言，1,8-萘甲酰胺（化合物1）进行烷基化后进行离子交换得到中间体化合物2，该中间体

结论

据我们所知，我们首次报道了一种明亮的近红外-Ⅱ区荧光LMP（CL1）用于高效标记具有脂质双层结构（LBS）的纳米囊泡，这为同种GBM的诊断和治疗提供了出色的性能。实现高效和明亮标记的关键在于将脂质尾与近红外-Ⅱ区吸收和发射菁染料共价共轭，赋予其结构与LBS脂质组分的结构相似性和物理化学相似性。这

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娄一娜：撰写——初稿、可视化、验证、软件、方法学、调查、正式分析、数据整理。王伟：撰写——初稿、监督、软件、资源、项目管理、方法学、调查、资金获取、正式分析、数据整理。黄海炎：撰写——初稿、可视化、方法学、调查、数据整理。Haroon Ahmad：撰写——初稿、软件、方法学、调查、正式

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作者声明无利益冲突。

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致谢

黄海炎、王伟和娄一娜对本工作贡献同等。作者感谢深圳市科技计划（JCYJ20240813105122030）、广东省基础与应用基础研究基金（2025A1515011922、2026A1515010456）。所有动物实验均按照实验室动物饲养和使用指南进行，并得到昆明医科大学机构生物医学研究伦理委员会批准（KMMUX202502029）。作者

黄海炎|王伟|娄一娜|颜雨倩|Haroon Ahmad|李梦龙|贾青云|严义斌|胡根文|范智君|郭炳

中国哈尔滨工业大学深圳校区理学院-518055，中国