《Bioresource Technology》：Biobutanol production from rice straw using a redox-modulated fungal-bacterial consortium: Transcriptional regulation and process integration
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•真菌-细菌共培养体系实现免酶解稻草直接生产丁醇。•T. reesei 为 C. beijerinckii 的生长提供纤维素酶和消耗氧气。•通过优化稻草和 L-半胱氨酸浓度，实现了3.09 g/L的丁醇产量。•低氧条件诱导T. reesei进行乙醇发酵和木质纤维素水解。•L-
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真菌-细菌共培养体系实现免酶解稻草直接生产丁醇。
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T. reesei 为 C. beijerinckii 的生长提供纤维素酶和消耗氧气。
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通过优化稻草和 L-半胱氨酸浓度，实现了3.09 g/L的丁醇产量。
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低氧条件诱导T. reesei进行乙醇发酵和木质纤维素水解。
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L-半胱氨酸可能重新分配碳通量，提高丁酸盐产生和酸吸收。
引言
木质纤维素生物质以其可持续性、成本效益和丰富可获取性，已成为生产生物乙醇、生物丁醇和沼气的重要原料（Sikiru等，2024）。与乙醇相比，丁醇具有更高的能量密度、更低的挥发性、更弱的吸湿性和极小的腐蚀性，使其成为有前景的下一代液体生物燃料（Jin等，2011）。生物丁醇通常由Clostridium beijerinckii（拜氏梭菌）通过丙酮-丁醇-乙醇（ABE）发酵生产，该菌可利用农业废弃物中衍生的己糖和戊糖（Pinto等，2021）。在生物丁醇生产研究中，稻草、玉米秸秆和甘蔗渣等农业废弃物常被用作低成本的木质纤维素底物（Guo等，2022）。稻草的年产全球产量约为3.7至5.2亿吨（Van Hung等，2020），是生物丁醇生产的重要潜在资源。然而，稻草转化涉及多阶段生物炼制工艺，包括预处理、酶解糖化、发酵和产品回收，这些工序通常作为独立的单元操作进行，导致工作流程不连续（Ge等，2025）。特别是，对外源酶的单独水解步骤需求，给从上游处理到发酵的流程简化带来了重大挑战（Ding等，2024）。
生物合成整合（CBP）可以将纤维素分解酶生产和发酵整合为单一工序（Xin等，2019）。它通过原位酶产生消除了对外源酶的昂贵添加需求，为木质纤维素生物质生产生物丁醇提供了一种具有成本效益的范式（Barcelos等，2021）。尽管已开发了用于木质纤维素底物CBP的基因工程菌株，但将高效的木质纤维素分解与强健的产品合成整合于一个生物体内仍是主要挑战（Tsoi等，2018）。在此背景下，一个特别有吸引力的概念是将纤维素分解真菌与溶剂产生细菌配对，从而将高效水解与强力的丁醇生产能力相结合。
然而，真菌-细菌CBP生产丁醇仍然面临挑战，因为真菌需要氧气，而溶剂产生梭菌是严格厌氧菌。此前研究曾尝试解决好氧-厌氧冲突。Shahab等人利用膜曝气生物反应器在Trichoderma reesei（里氏木霉）生物膜中建立氧气梯度，从而实现了木质纤维素生物质向乳酸的转化（Shahab等，2018）。然而，将该系统从乳酸扩展到由严格厌氧菌生产短链脂肪酸，则需要更复杂的平台来充分降低氧化还原电位（ORP）（Shahab等，2020）。另一种替代策略是分次接种，将好氧真菌生长与厌氧细菌生产分离。Tri等人利用Phlebia sp.（褐腐真菌）积累酶，同时维持Clostridium saccharoperbutylacetonicum（糖化产丁醇梭菌）所需的还原条件（Tri等，2024）。然而，发现Phlebia sp.在随后厌氧条件下会积累大量乙醇，将碳通量从梭菌丁醇合成中转移（Tri & Kamei, 2020）。
T. reesei RUT-C30已被确立为工业生产用高产量纤维素酶的主要生产菌株（Bischof等，2016）。此外，T. reesei具有一定的厌氧发酵能力，尽管细胞生长较低且纤维素酶活性略有下降（Xu等，2015）。这些优势为T. reesei RUT-C30处理更高底物负荷和减少碳损失提供了可能。C. beijerinckii已在传统单菌培养和共培养工艺中用于从稻草生产丁醇（Wu等，2020）。然而，在这些系统中，木质纤维素水解依赖于单独生产或外源提供的纤维素酶，而非由活性真菌伙伴整合到溶剂产生发酵中的纤维素酶生产。此外，当前合成共培养体系仍受限于较低的底物负荷，约为1%-3%（w/v），而其背后的机制，特别是真菌对低氧的适应和细菌对氧化还原调节的响应，仍未得到充分理解。
在本研究中，我们开发了一种合成微生物共培养体系，利用纤维素分解真菌T. reesei RUT-C30和溶剂产生细菌C. beijerinckii NCIMB 8052，直接从碱预处理稻草（RS）生产丁醇。首先使用微晶纤维素（MCC）建立了T. reesei/C. beijerinckii共培养体系的可行性。然后以稻草为底物，通过调整底物负荷优化了共培养体系的丁醇生产。系统性能还通过使用0.5 g/L L-半胱氨酸补充剂调节ORP进行了评估。此外，进行了比较转录组学分析，以阐明真菌适应低氧条件的转录调控和细菌对氧化还原调节的响应。本研究推进了对协作微生物网络的理解，并为开发用于可持续木质纤维素生物燃料生产的CBP平台提供了潜在框架。
章节摘要
稻草碱预处理
将RS进行机械粉碎和筛分，以达到1–3 mm的粒径范围。随后，将RS浸泡在1.0%（w/v）NaOH溶液中，固液比为1:15（w/v），以溶解木质素。在50°C静态培养72小时后，收集固体残渣并用去离子水洗涤至滤液呈中性。最后，将预处理后的RS在60°C下烘箱干燥至恒重，并在干燥环境条件下储存。
T. reesei/C. beijerinckii共培养体系生产丁醇的可行性
以MCC作为模型底物，评估了T. reesei和C. beijerinckii合成共培养体系在丁醇生物合成整合发酵中的可行性。在培养的初始3天内，T. reesei作为纤维素降解剂和纤维素酶生产者，在系统中积累了0.59 ± 0.15 g/L还原糖（图1A）。由于T. reesei的快速呼吸和高度代谢活性，在酶生产阶段溶解氧浓度降至0.03 mg/L以下并保持
结论
本研究成功建立了T. reesei/C. beijerinckii共培养体系，通过CBP直接从碱预处理稻草生产生物丁醇。未经过基因改造，该共培养体系实现了3.09 g/L的丁醇产量，产率和生产率分别约为0.069 g/g初始预处理RS和0.018 g/(L·h)。这一成功得益于T. reesei RUT-C30的双重功能，即在适宜温度下同时产生纤维素酶并消耗氧气
CRediT作者贡献声明
Yiyang Fan（樊怡阳）： 原稿撰写、可视化、方法论、调查、形式分析、数据整理、概念构思。Jianzheng Li（李建正）： 监督、资源、项目管理、资金获取。Quan He（何全）： 验证、软件、数据整理。Chen Cai（蔡晨）： 撰写—审阅与编辑、软件、资源。Jia Meng（孟佳）： 撰写—审阅与编辑、资源、项目管理、资金获取。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在可能影响本论文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
作者衷心感谢国家自然科学基金委员会（基金号 52270100）、国家重点研发计划（基金号 2022YFD1601000）、中国黑龙江省自然科学基金（基金号 YQ2024E028）和哈尔滨工业大学城乡水资源与环境国家重点实验室（基金号 2025DX14）。
Yiyang Fan|Jianzheng Li|Quan He|Chen Cai|Jia Meng
