工程化O-甲基转移酶与SAM-ATP辅因子循环以在大肠杆菌中实现高效褪黑素生物合成

《Bioresource Technology》：Engineering O-methyltransferase and SAM-ATP cofactor cycle for high-efficiency melatonin biosynthesis in Escherichia coli

　　

• •
  开发了一种整合能量分析与保守性分析的共识策略。
• •
  PPRS策略构建了M2变体，活性提高了8.10倍。
• •
  通过工程改造SAM循环和嘌呤补救途径，克服了辅因子限制。
• •
  工程菌株实现了1.48 g/L褪黑素的从头合成。
• •
  该综合框架可迁移应用于其他甲基化依赖性产物的合成。

引言

褪黑素是一种进化上保守的吲哚胺，在植物和动物中均发挥着关键的生理功能（Mannino等，2021）。在植物中，它能缓解干旱和极端温度等非生物胁迫（Michalek等，2025），而在动物和人体中，它能调节昼夜节律、发挥抗氧化和免疫调节作用，并提供神经保护作用（Ahmadi等，2024；Comai和Gobbi，2024）。目前，工业化规模的褪黑素生产依赖于涉及危险试剂的多步化学合成（Hugel和Kennaway，1995），或从昂贵且受季节限制的植物中提取（Arnao等，2023）。随着合成生物学的进步，微生物细胞工厂已成为绿色高效褪黑素生物合成的有前景的替代方案（Ji等，2026；Liu等，2022a）。

从色氨酸出发的异源途径已成功在大肠杆菌和酿酒酵母中建立。Germann等人（2016）首次在酿酒酵母中实现了14.5 mg/L的褪黑素产量。Luo等人（2020）通过工程改造的色氨酸羟化酶和途径缺失，报告了在大肠杆菌中的克级生产。最近，通过AI辅助的酶挖掘或BH₄非依赖性途径设计，在补充外源色氨酸的条件下，分别报告了6.2 g/L（Qu等，2026）和3.40 g/L（Wan等，2026）的滴度。尽管取得了上述进展，工业应用仍受到酶活性不足、辅因子供应不平衡以及通量分布不匹配的限制（Xie等，2022）。

O-甲基转移酶（OMT）催化最后的甲基化步骤，其催化效率直接决定了产物的积累。天然OMT对非天然底物N-乙酰血清素（NAS）表现出热稳定性差和催化效率低的问题（Bennett等，2017）。先前的工程改造努力，如拟南芥咖啡酸3-O-甲基转移酶三重突变体（AtCOMT^{C296F-Q310L-V314T}）活性提高了9.5倍（Wang等，2019），以及水稻咖啡酸3-O-甲基转移酶突变体（OsCOMT^C303F-V321T）褪黑素产量提高了5倍（Zhang等，2021），已证明了OMT优化的可行性。人类乙酰血清素O-甲基转移酶（HsASMT）的结合口袋经过工程改造，获得了催化效率提高6.1倍、摇瓶规模褪黑素滴度达742.13 mg/L的突变体（Chen等，2026）。然而，设计具有高活性、优良热稳定性和良好底物兼容性的OMT仍然是一个主要挑战。

褪黑素的生物合成还依赖于协调的辅因子供应。色氨酸羟化需要四氢生物蝶呤（BH₄），而OMT需要S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体（Xie等，2022）。SAM的合成消耗ATP，其副产物S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）会抑制甲基转移酶。因此，仅优化关键酶是不够的，同样重要的是系统性地重建辅因子网络（Effendi和Ng，2023），包括加强SAM的合成与再生（Zhang等，2026c）、加速SAH清除（Liu等，2022b），以及建立高效的ATP回收途径（Zhang等，2025），以支持高需求的甲基化反应。

计算机辅助蛋白质设计的最新进展使其成为酶工程中不可或缺的工具（Lv等，2026）。同时，代谢工程已从简单的途径表达发展为多模块协调调控与动态优化（Sun等，2025）。在本研究中，一种系统性的工程方法被应用于大肠杆菌，以克服褪黑素生物合成的瓶颈。通过将自由能计算与进化保守性分析相结合，在不损害活性的情况下设计了热稳定突变体M1（T32V-S52F-N321F）。在此基础上，通过重塑底物结合口袋的极性微环境，构建了高活性突变体M2（T32V-S52F-I316S-F321T）。分子动力学（MD）模拟显示，增强的链间相互作用提高了蛋白质的热稳定性，而更好的底物取向和辅酶结合距离则增加了催化活性。代谢工程进一步平衡了色氨酸与BH₄生物合成之间的碳通量，重建了SAM合成与SAH水解循环，设计了高效的腺苷到ATP的再生途径，并阻断了竞争能量和SAM的途径。以甘油为碳源，最终菌株M31在5升规模上实现了1.48 g/L褪黑素的从头合成。本研究为其他甲基化依赖性且能量密集型天然产物的合成提供了通用的工程范式。

章节摘要

菌株与质粒

大肠杆菌BL21(DE3)被用作初始宿主菌株。所有工程菌株均由此衍生（详细的基因型与构建信息见表S1）。大肠杆菌JM109被用于质粒构建。HsTPH^MS4突变体的基因来自本实验室先前的工作。褪黑素生物合成途径中的其他异源基因针对大肠杆菌进行了密码子优化，并由Azenta Life Sciences（中国苏州）合成。所使用的异源基因列于

褪黑素生物合成途径的构建

为了在大肠杆菌中建立完整的褪黑素生物合成途径，引入了包括羟化酶、脱羧酶、N-乙酰转移酶和O-甲基转移酶在内的异源酶。在植物途径中，羟化发生在脱羧之后，作用于色胺，这与动物途径不同（图1A）。因此，由于植物来源的色胺羟化酶在大肠杆菌中活性较低（Zhou等，2021），未被考虑。在先前的工作中，人类的一种突变体

结论

褪黑素生物合成途径中涉及的异源酶通常表现出广泛的底物特异性。通过对途径酶的底物特异性筛选，建立了一种独特的反应顺序，有效避免了副产物N-乙酰色胺的形成。为了解决O-甲基转移酶固有的热稳定性差和催化活性低的问题，将自由能计算与进化保守性分析相结合，设计了热稳定突变体M1。

CRediT作者贡献声明

韩金：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，方法学，调查。尤佳佳：方法学，资金获取。朱星宇：验证，方法学。张一帆：验证，方法学。张松林：验证，方法学。潘学伟：监督，资金获取。邵明龙：监督，资金获取。陈先忠：撰写——审阅与编辑，监督。饶志明：撰写——审阅与编辑，监督，资金获取。

声明生成式AI与AI辅助技术在写作过程中的使用

在本工作的准备过程中，作者使用了ChatGPT来修正语法和语言错误。在使用该工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对已发表文章的内容承担全部责任。

未引用的参考文献

Byeon和Back，2016；Byeon等，2015；Byeon等，2014；Park等，2013；Wang等，2024b；Zhang等，2026b。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文中报告的工作。

致谢

本研究得到以下基金资助：国家重点研发计划（编号：2023YFA0914500，2023YFD1300700），江苏省前沿技术研发计划（BF2024012），国家自然科学基金（编号：32471530和32300063），食品科学与工程国家重点实验室研究计划，江南大学（编号：SKLF-ZZB-202408），以及中央高校基本科研业务费专项资金（编号：JUSRP202501034）。

韩金|尤佳佳|朱星宇|张一帆|张松林|潘学伟|邵明龙|陈先忠|饶志明