酿酒酵母双区室代谢工程同时合成白藜芦醇

《Bioresource Technology》：Simultaneous synthesis of resveratrol by dual-compartment metabolic engineering in Saccharomyces cerevisiae

　　

白藜芦醇（3,4′,5-三羟基-1,2-二苯乙烯）是一种植物来源的多酚类化合物，广泛存在于虎杖、花生、葡萄和蓝莓等植物中。它具有多种生理活性，包括抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、抗衰老和心血管保护作用，广泛应用于医药、保健、营养和化妆品领域。受这些健康相关益处的驱动，根据QYResearch的报告，全球白藜芦醇市场预计将从2025年的9083万美元显著增长至2032年的1.64亿美元。为满足这一巨大的市场潜力和日益增长的需求，白藜芦醇的微生物合成提供了一种可持续且可规模化的替代方案，以替代对环境有害的化学合成或从天然植物来源中高成本提取。 大多数微生物缺乏白藜芦醇合成所必需的酶。因此，微生物异源表达苯丙氨酸解氨酶（PAL）和肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）和二苯乙烯合酶（STS），或酪氨酸解氨酶（TAL）、4CL和STS至关重要。代谢工程、蛋白质工程和发酵工艺优化已在多种微生物底盘菌株中实现了白藜芦醇的合成，包括大肠杆菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），以及真核生物如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、毕赤酵母（Pichia pastoris）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）。研究人员建立了概率计算模型来调控限速酶的来源选择和浓度，将大肠杆菌中的白藜芦醇产量从62.5 mg/L提高至172.8 mg/L。组合策略包括酪氨酸和苯丙氨酸途径的协同运作、异源途径的多位点整合、关键酶的组装、中间代谢通量的重构以及细胞形态的严格控制，已在酿酒酵母和解脂耶氏酵母中实现了白藜芦醇的高效生物合成。 除上述优化策略外，白藜芦醇的产量主要受前体（芳香族氨基酸酪氨酸或苯丙氨酸）和丙二酰-CoA供应不足的限制。研究人员已开发多种酵母工程策略以提高乙酰-CoA/丙二酰-CoA供应并增加酵母中丙二酰-CoA衍生代谢物的滴度：破坏Snf1依赖性乙酰-CoA羧化酶（ACC1）磷酸化、异源过表达植物丙二酰-CoA合成酶，以及辅因子和中心碳通量重构。然而，丙二酰-CoA合成酶的过表达会扰乱中心代谢稳态。在此背景下，探索远离中心碳代谢的细胞器内丙二酰-CoA库，为解决区室化代谢瓶颈并推进天然产物生物合成提供了机会。 由于乙酰-CoA是丙二酰-CoA合成的直接前体，提高乙酰-CoA的可用性也可增加酿酒酵母中白藜芦醇的产量。过氧化物酶体、细胞质和线粒体中的乙酰-CoA库可协同作用，增加向一系列乙酰-CoA衍生化合物（如萜类、甾醇和聚酮类）的生物合成通量。空间隔离可最大限度地减少副产物和竞争反应，并降低目标产物的细胞毒性效应，从而提高细胞活力和发酵稳定性。因此，将合成途径靶向至细胞器已成为大幅提高产量的有力策略。前期研究通过重塑过氧化物酶体的丰度和形态、优化辅因子供应以及过表达异源生物合成途径，提高了过氧化物酶体脂肪酸β-氧化的效率，实现了酵母中基于过氧化物酶体的黄酮类和萜类化合物的高效合成，凸显了过氧化物酶体区室工程的技术潜力。然而，双区室工程的贡献在很大程度上仍未得到探索。该策略兼具单一过氧化物酶体工程的优势，并通过协同利用细胞质和过氧化物酶体前体库进一步扩展细胞内乙酰-CoA的可用性。 在本研究中，研究人员在过氧化物酶体中构建了功能性白藜芦醇合成途径，并结合互补的细胞质途径，实现了酿酒酵母中白藜芦醇的双区室同步合成。通过13C代谢通量分析（13C-MFA），研究人员系统表征了白藜芦醇合成涉及的关键代谢物，并阐明了双区室工程菌株的潜在代谢机制。这项工作表明，亚细胞区室工程为微生物合成生化产品提供了一个新颖而有效的平台。

论文解读：酿酒酵母双区室代谢工程同时合成白藜芦醇

一、研究背景与科学问题

白藜芦醇是一种植物来源的多酚类化合物，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、抗衰老及心血管保护等多种生理活性，在医药、保健、营养和化妆品领域应用广泛。全球白藜芦醇市场预计将从2025年的9083万美元增长至2032年的1.64亿美元。传统的植物提取和化学合成方法存在成本高、环境污染等问题，微生物异源合成被视为可持续且可规模化的替代方案。然而，大多数微生物缺乏白藜芦醇合成所需的酶，需要通过异源表达酪氨酸解氨酶（TAL）、4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）和二苯乙烯合酶（STS）等关键酶来实现合成。

白藜芦醇的产量主要受前体供应限制，包括芳香族氨基酸（酪氨酸或苯丙氨酸）和丙二酰-CoA。已有研究通过多种策略提高乙酰-CoA/丙二酰-CoA供应，但丙二酰-CoA合成酶的过表达会扰乱中心代谢稳态。乙酰-CoA作为丙二酰-CoA的直接前体，其在过氧化物酶体、细胞质和线粒体中的库可协同增加向目标化合物合成的生物合成通量。空间隔离可减少副产物和竞争反应，降低目标产物的细胞毒性，提高细胞活力和发酵稳定性。前期研究已实现基于过氧化物酶体的黄酮类和萜类化合物高效合成，但双区室工程的贡献尚未被探索。本研究旨在通过同时利用细胞质和过氧化物酶体前体库，构建双区室工程菌株，实现白藜芦醇的高效合成。该论文发表在《Bioresource Technology》。

二、关键技术方法

研究人员采用CRISPR-Cas9介导的多位点基因组整合方法，将白藜芦醇合成基因整合至酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因组中。通过构建多gRNA质粒实现多位点同时编辑，经三轮迭代整合使目标基因拷贝数增加十倍。采用SKL信号肽将酶靶向至过氧化物酶体。通过荧光共定位实验（GFP-PEX3与mCherry-SKL）验证蛋白的过氧化物酶体定位。利用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）和高效液相色谱（HPLC）进行产物鉴定与定量。采用13C代谢通量分析（13C-MFA）结合超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS/MS）测定中心代谢中间物的质量同位素分布向量，计算代谢物的13C标记分数和含量。发酵实验包括摇瓶发酵和5 L生物反应器补料分批发酵。

三、研究结果

3.1 不同细胞区室中的白藜芦醇合成

研究人员首次在酿酒酵母的不同细胞区室中建立了白藜芦醇合成途径。选择仅需TAL、4CL和STS三种外源酶的酪氨酸途径，将来自Herpetosiphon aurantiacus的TAL基因、拟南芥（Arabidopsis thaliana）的4CL基因和葡萄（Vitis vinifera）的STS基因经密码子优化后通过CRISPR-Cas9系统整合至基因组。构建了细胞质区室菌株Rev02和过氧化物酶体区室菌株Rev03。Rev03中TAL-SKL、4CL-SKL、STS-SKL和ACC1-SKL通过C端SKL信号肽靶向过氧化物酶体。荧光共定位实验证实SKL标记酶有效靶向过氧化物酶体。LC-MS/MS分析确认目标产物为反式白藜芦醇。摇瓶发酵中，细胞质菌株Rev02的白藜芦醇滴度为53.79±3.78 mg/L，比生产率为74.32±1.69 μg/gDCW/h；过氧化物酶体菌株Rev03的滴度为34.67±1.53 mg/L，但比生产率达119.79±7.05 μg/gDCW/h，较细胞质菌株提高61%。

3.2 过氧化物酶体中白藜芦醇合成模块的高效组装

为增强过氧化物酶体区室菌株Rev03的合成能力，研究人员构建了7.4 kb的融合表达盒（PTEF1-TAL-SKL-PTPI1-4CL-SKL-PTEF2-STS-SKL），并通过多位点整合方法同时整合至多个基因组位点。经三轮迭代整合，Rev04（4拷贝）、Rev05（7拷贝）和Rev06（11拷贝）的产量分别为34.48±2.93、45.28±6.53和104.23±7.66 mg/L。Rev06较Rev03提高200%。RT-qPCR分析显示TAL和STS的cDNA丰度分别为4CL的5.3倍和4.8倍，表明基因表达不仅由基因剂量决定，启动子差异和转录调控也显著影响转录效率。

3.3 通过系统代谢工程增强前体供应模块

研究人员将前体供应模块分为三个节点进行强化。节点1过表达ACC1-SKL增加丙二酰-CoA合成，Rev07产量达158.25±7.43 mg/L，较Rev06提高52%。节点2同时过表达PXA1、PXA2（脂肪酸转运蛋白）和FAS1、FAS2（脂肪酸合酶亚基），Rev08产量达226.63±19.16 mg/L，较Rev07提高43%。节点3过表达POX1-SKL、FOX2-SKL和POT1-SKL增强β-氧化途径，Rev09产量达271.91±3.18 mg/L，为Rev06的2.61倍。

3.4 双区室代谢工程合成白藜芦醇

将细胞质白藜芦醇合成模块整合至Rev01和Rev09，分别获得细胞质区室菌株Rev10和双区室菌株Rev11。在5 mM酪氨酸条件下，Rev10、Rev09和Rev11的产量分别为89.69±1.83、271.91±3.18和308.69±1.54 mg/L，Rev11较Rev09提高13%。5 L生物反应器补料分批发酵中，Rev09和Rev11的产量分别为319.35和350.01 mg/L。通过恢复Rev11的营养缺陷型（URA3、ADE2、HIS3、LEU2、TRP1），获得菌株Rev14，最大OD600从19.88提高至30.10，最终白藜芦醇浓度达552.16 mg/L（72小时），酪氨酸和葡萄糖产率分别为0.45 g/g和0.006 g/g，总生产率为7.67 mg/L/h，细胞干重为11.14 g/L。

3.5 13C-MFA揭示细胞区室代谢机制

通过13C-MFA比较细胞质区室菌株Rev12、过氧化物酶体区室菌株Rev13和双区室菌株Rev14的代谢差异。48小时时，Rev12的乙酰-CoA标记分数为98.01±2.81%，而Rev13和Rev14分别为72.38±1.38%和74.16±2.65%，表明过氧化物酶体工程菌株的乙酰-CoA来源更多样化。Rev14的白藜芦醇含量为991.38±187.88 nmol/gDCW，约等于Rev12（236.30±19.11 nmol/gDCW）和Rev13（786.22±78.53 nmol/gDCW）之和。过氧化物酶体工程菌株的乙酰-CoA含量显著高于细胞质菌株。Rev13和Rev14中谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和甘氨酸的积累增加，支持谷胱甘肽（GSH）合成和细胞耐受性增强。

四、讨论与结论

讨论部分指出，双区室工程策略实现了两个物理分离的乙酰-CoA库的协同利用，克服了单细胞器容量限制，减轻了前体合成、蛋白转运和中间产物积累的代谢负担。空间隔离提高了途径特异性，避免了内源代谢干扰。13C-MFA结果表明过氧化物酶体是白藜芦醇合成的可行位点，其乙酰-CoA含量显著增加。双区室菌株的产量接近两个单区室菌株之和，但发酵最大产量未达各自之和，可能与细胞内残留白藜芦醇有关，未来需鉴定白藜芦醇转运蛋白。与已报道的最高产量4.1 g/L相比，本研究主要聚焦于双区室策略验证，未进行芳香族氨基酸前体库的靶向工程，发酵条件和补料策略仍需优化。

研究结论：本研究建立了双区室代谢工程策略，通过系统改造过氧化物酶体途径、优化前体供应并结合细胞质途径，构建了高效合成白藜芦醇的双区室菌株。恢复营养缺陷型的双区室菌株产量达552.16 mg/L。13C-MFA结果表明双区室菌株的白藜芦醇积累量接近两个单区室菌株之和，工程化过氧化物酶体因乙酰-CoA水平显著提高而成为白藜芦醇合成的可行位点。双区室工程是合成白藜芦醇的高效策略，为微生物合成生化产品提供了通用平台。