使用糖聚合物表面进行生物传感时热处理对蛋白质的影响

《Biosensors and Bioelectronics: X》：Effect of Heat Treatment on Protein for Biosensing using Glycopolymer Surface

　　

摘要翻译：
糖聚合物是通过在其聚合物骨架上呈现聚糖单元而设计的合成聚合物，能够利用簇糖苷效应与凝集素等靶标进行特异性且强效的相互作用。本研究探讨了热处理对花生凝集素（peanut agglutinin, PNA）结构的影响，以及由此引起的表面等离子体共振成像（surface plasmon resonance imaging, SPRi）信号变化。研究人员通过可逆加成-断裂链转移（reversible addition-fragmentation chain transfer, RAFT）聚合合成了具有不同半乳糖比例的糖聚合物，并将其直接固定到金（Au）表面。将参考态和热变性态的PNA吸附到糖聚合物表面，定量分析了糖密度与蛋白质结合行为之间的相关性。研究发现，在30°C下，PNA仍保持其四聚体结构，并以多价特异性方式与半乳糖结合；而在60°C和90°C下，热变性导致蛋白质去折叠，使特异性结合转向非特异性吸附。此外，具有中等半乳糖密度（Gal-30至Gal-70）的糖聚合物对参考态和变性态PNA均表现出最佳的特异性相互作用。这些结果强调了优化糖密度和保持蛋白质构象稳定性对于开发可靠的基于糖聚合物的生物传感器至关重要。

论文解读：
**研究背景与目的**
生物传感器由生物识别元件和信号转换器组成，广泛应用于医疗诊断、食品安全和环境监测。表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）及其成像技术（SPRi）因具有高灵敏度、实时检测和无标记测量等优势，成为研究生物分子相互作用的常用工具。为实现特异性识别，传感器表面通常需要固定抗体、核酸适配体或聚糖等识别分子，但传统固定方法往往涉及多步、耗时的表面修饰过程。糖聚合物作为合成聚合物，其主链上密集或可控地展示聚糖单元，可通过簇糖苷效应与凝集素发生强效特异性结合，且比抗体更稳定，并能通过聚合方法精确控制结构参数，因此被开发用于直接固定到金表面以检测凝集素或细胞。然而，在生物传感应用中，环境条件如pH和温度会影响凝集素的稳定性和结合活性，而既往研究很少专门探讨蛋白质热变性对SPR信号或结合亲和力的影响。花生凝集素（PNA）是研究β-半乳糖苷和β-乳糖苷结构的模型凝集素，本研究以PNA为靶蛋白，系统考察了热处理引起的蛋白质结构变化对SPRi信号及糖聚合物-PNA结合行为的影响，旨在为开发更可靠的糖聚合物生物传感器提供依据。

**主要技术方法**
研究人员采用可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合合成了以聚丙烯酰胺（PAAm）为主链、侧链修饰α-半乳糖（α-Gal）或α-甘露糖（α-Man）的系列糖聚合物，并通过还原RAFT试剂端基获得末端硫醇，实现糖聚合物在金表面的直接固定。糖聚合物的化学结构通过核磁共振（NMR）谱表征，分子量和分布通过凝胶渗透色谱-多角度光散射（GPC-MALS）测定。SPRi芯片采用S-TIH10玻璃基板，经疏水化处理后溅射Cr/Au薄膜，形成28个金斑点。将不同糖聚合物溶液滴加到金斑点并孵育固定后，利用SPRi系统实时监测PNA吸附引起的反射光强度变化（Δ%R）。PNA样品溶于磷酸盐缓冲液，通过水浴分别在30°C、60°C和90°C热处理90分钟获得变性蛋白，再流经糖聚合物表面进行结合分析。结合曲线采用Langmuir模型拟合，计算结合常数（K_a）和解离常数（K_D）。

**研究结果**
**糖聚合物的表征与固定**
所有糖聚合物均通过RAFT聚合合成，设计链长为100-mer。NMR和GPC-MALS结果表明，各聚合物的单体转化率在92%–99%之间，糖基嵌入比例与投料比基本一致，聚合物分散指数（PDI）≤1.2，表明聚合过程可控。测得的分子量略高于理论值，可能是部分RAFT试剂失活所致。糖聚合物通过末端硫醇与金表面形成Au-S键固定，SPRi信号随浓度增加而增强并在2.5 mg/mL时达到饱和，吸附行为符合Langmuir模型，表明糖聚合物在金表面形成单层膜。

**PNA在不同糖聚合物表面的吸附**
研究人员将200 nM参考态PNA流经固定有不同糖聚合物（Gal-10、Gal-30、Gal-50、Gal-70、Gal-100、Man-100和PAAm-100）的SPRi芯片。结果显示，Gal-30产生最高的Δ%R值，而Gal-10最低。这是因为Gal-30具有最优的半乳糖密度，PNA能够有效接近并结合多个半乳糖位点，形成簇糖苷效应；半乳糖密度过高时空间位阻限制了PNA的接近，密度过低则阻碍多价相互作用。Man-100和PAAm-100表面几乎无信号，证实了PNA对半乳糖的特异性识别。结合常数K_a则随半乳糖密度增加而增大，Gal-100表现出最高的K_a（9.1 × 10⁶ M^?1），说明高糖密度增强局部结合亲和力。

**热处理对PNA结合亲和力的影响**
PNA是由四个单体通过非共价作用组装而成的四聚体，每个单体表面具有半乳糖结合口袋。30°C处理90分钟后，PNA仍保持四聚体结构，但亚基间相互作用减弱，导致在甘露糖修饰表面出现非特异性响应。60°C时四聚体解离并伴随三级结构破坏，半乳糖结合口袋被扰乱，疏水和带电残基暴露，促进非特异性疏水和静电吸附。90°C时蛋白质进一步去折叠，特异性结合能力丧失，Gal-30至Gal-70表面出现大量无法可靠拟合的K_a值。定量分析表明，30°C下Gal-30信号最强，Gal-100的K_a为7.0 × 10⁶ M^?1；60°C下Gal-100仍具有最高信号和K_a（6.6 × 10⁶ M^?1），表明高糖密度可通过增强多价相互作用部分补偿结构损失；90°C下大多数糖聚合物表面的结合行为变为非特异性。

**结论与意义**
本研究证明RAFT聚合可制备具有可控半乳糖密度的糖聚合物，其中Gal-30产生最高的SPRi响应，而Gal-100具有最大的结合常数。热变性实验揭示，超过30°C的加热会逐步破坏PNA的四级和三级结构，使特异性多价结合转变为非特异性吸附，并降低对糖聚合物表面的选择性。中等半乳糖密度（Gal-30至Gal-70）的糖聚合物对参考态和变性态PNA均能提供最佳特异性相互作用。这些发现强调，优化糖基密度和维持蛋白质构象稳定性对于设计可靠的糖聚合物生物传感器至关重要。研究也存在局限：SPRi仅测量传感器表面附近的折射率变化，无法完全区分变性PNA产生的响应究竟是源于非特异性吸附还是聚集体沉积，未来可结合动态光散射、石英晶体微天平（QCM-D）或原子力显微镜（AFM）等互补技术加以鉴别。该研究为理解糖聚合物-蛋白质相互作用机制及开发耐环境干扰的生物传感器提供了重要参考，同时可扩展至其他半乳糖结合凝集素，以评估结构-亲和力关系的普适性。