CRISPR/Cas14a-SNPT：一种经过工程改造的 sgRNA 不匹配检测平台，用于遗传性 G6PD 缺乏症中超高灵敏度的 SNP 分型

《Biosensors and Bioelectronics》：CRISPR/Cas14a-SNPT: An engineered sgRNA mismatch-enabled platform for ultrasensitive SNP typing in hereditary G6PD deficiency

　　

摘要

单核苷酸多态性（SNP）检测在遗传性疾病的早期筛查和基因分型中起着关键作用。在本研究中，以遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症为模型，开发了一种基于CRISPR/Cas14a的SNP基因分型平台（CRISPR/Cas14a-SNPT）。该平台结合了重组酶聚合酶扩增（RPA）信号放大技术和优化的sgRNA设计。通过引入缩短的优化sgRNA（op-sgRNA）来增强Cas14a的活性，并通过engineering sgRNA错配调节，实现了快速、高灵敏度和高分辨率的SNP检测。结果表明，该平台对质粒模板的检测限为1个拷贝/μL，并能可靠地区分低至0.1%的变异等位基因频率。在临床验证中，该方法成功地在13个人血样本中识别出三个热点突变（c.95A > G、c.1388G > A和c.1376G > T），其结果与焦磷酸测序结果高度一致。此外，分子动力学模拟揭示了Cas14a在分子水平上的错配识别机制，表明额外的错配会诱导双链松弛和结构补偿效应，从而提高目标识别的特异性。本研究为G6PD缺乏症相关SNP的准确基因分型和产前携带者筛查提供了一种高效实用的策略，展示了其在快速检测临床相关SNP方面的巨大潜力。

引言

单核苷酸多态性（SNP）是基因组中最常见的遗传变异类型，在遗传性疾病的早期筛查、基因分型诊断和产前检测中发挥着关键作用（Chen等人，2025年；Hao等人，2025年）。例如，SNP检测已广泛应用于地中海贫血（Alwazani等人，2016年）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症（Zheng等人，2020年；Tacoli等人，2025年）和BRCA1/2基因突变（De Leeneer等人，2009年）的风险评估和基因分型。准确区分野生型（WT）、杂合子型（HET）和纯合子突变型（HOM）不仅有助于疾病风险评估，还为个性化医疗策略的发展提供了重要基础。

遗传性G6PD缺乏症是一种X连锁的酶缺乏症，其发病机制与G6PD基因中的特定SNP密切相关。临床表现主要是溶血性贫血、新生儿高胆红素血症和药物诱导的溶血（Fastuca等人，2025年；Vongbhavit等人，2025年），部分患者在围产期会出现明显的胆红素水平升高。此外，携带G6PD缺乏症的孕妇在感染或接触某些药物（如磺胺类药物或硝基呋喃衍生物）时容易发生急性溶血，这可能危及母婴健康（Sarkar等人，2022年；Belfield和Tichy，2018年）。因此，早期检测相关致病突变，尤其是在孕期进行携带者筛查，对于风险评估具有重要意义。目前，临床筛查主要依赖生化检测G6PD酶活性。然而，在杂合女性中，X染色体失活会导致酶活性水平分布广泛，可能导致假阴性诊断（Chen等人，2023年；Miao等人，2013年）。在中国人群中，c.1376G > T (rs72554665)、c.1388G > A (rs72554664) 和 c.95A > G (rs137852340) 是三种最常见的G6PD缺乏症相关变异。流行病学研究表明，这些热点变异约占中国G6PD缺乏症患者中检测到的变异的70-80%。因此，这些高频疾病相关变异被选为本研究中CRISPR/Cas14a-SNPT平台的主要检测目标，旨在建立一种针对临床相关热点SNP的快速准确分子基因分型策略（Tan等人，2024年；Zheng等人，2020年；He等人，2020年；Liu等人，2020年）。

分子基因分型方法，如PCR-RFLP（Ali Albsheer等人，2021年）、高分辨率熔解分析（HRM）（Boonyuen等人，2021年）和焦磷酸测序（Zhang等人，2025年），可以直接识别致病突变。然而，这些方法通常需要特定的实验流程和专业设备，这可能限制了它们在快速检测和资源有限环境中的应用。此外，基于等位基因特异性探针的方法，如TaqMan探针（Xue等人，2021年）和分子信标（Liao等人，2026年），已被广泛用于SNP基因分型，并能够通过探针与目标序列之间的特异性杂交实现单核苷酸区分。然而，这些方法通常需要为每个SNP位点设计特异性探针，其检测性能可能受到探针设计和杂交条件等因素的影响。因此，仍有必要开发具有高特异性、快速响应性和易实施性的SNP检测策略。

CRISPR/Cas系统凭借其可编程的核酸识别和切割特性，已成为高灵敏度SNP检测的强大工具（Ke等人，2021年；Chai等人，2025年）。特别是CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13系统，分别针对双链DNA和RNA，在病原体检测、遗传变异分析和生物标志物识别等领域得到了广泛应用。这些系统为基础开发了多个高灵敏度分子诊断平台，包括DETECTR（Chen等人，2018年）和SHERLOCK（Gootenberg等人，2018年），展示了其卓越的多功能性和可扩展性。近年来，Cas14a由于其无需PAM的目标识别能力和识别单链DNA（ssDNA）目标的能力，为CRISPR介导的高分辨率SNP检测提供了新的选择。尽管先前的研究尝试通过sgRNA工程改进CRISPR/Cas系统的单核苷酸区分能力，并将这些策略应用于癌症和其他疾病相关突变的检测（Lai等人，2025年；Yu等人，2025年；Gao等人，2023年；Been等人，2025年），但系统性的sgRNA设计策略对于高精度SNP基因分型的研究仍然不够充分，特别是在精确区分不同等位基因和错配如何调节Cas14a识别特异性方面。

在本研究中，开发了一种基于CRISPR/Cas14a的SNP分型平台（CRISPR/Cas14a-SNPT），用于检测与G6PD缺乏症相关的高频SNP位点。该平台结合了重组酶聚合酶扩增（RPA）以实现信号放大和快速等温检测，而工程化的单链引导RNA（sgRNA）错配显著提高了SNP区分的特异性和分辨率，从而能够准确区分野生型（WT）、杂合子型（HET）和纯合子突变型（HOM）等位基因。此外，分子动力学模拟从能量和构象动力学的角度阐明了错配诱导的“结构补偿效应”是高保真SNP识别的关键机制。这项工作不仅为遗传性G6PD缺乏症的精确基因分型和产前携带者筛查提供了高效策略，还展示了基于可编程sgRNA的方法在更广泛的临床SNP检测应用中的潜力。

章节摘录

材料

所有寡核苷酸和荧光淬灭剂（FQ）报告分子（序列：5′-6-FAM-TTTTTTTTTTTT-3′BHQ1）均由上海Sangon Biotech有限公司合成。Cas14a1蛋白和血液基因组DNA提取试剂盒也从上海Sangon Biotech有限公司购买。DNA纯化试剂盒及体外转录RNA合成和纯化试剂盒则从南京Vazyme Biotech有限公司获取。重组酶聚合酶扩增试剂盒亦从该公司购买。

CRISPR/Cas14a-SNPT系统的原理

本研究选择了与遗传性G6PD缺乏症相关的高频单核苷酸多态性（SNP）位点，包括rs137852340、rs72554664和rs72554665，开发了一种基于CRISPR/Cas14a的單碱基基因分型平台（CRISPR/Cas14a-SNPT）（图1）。整个实验流程包括两个主要步骤：

第一步，在37°C的等温条件下使用重组酶快速扩增目标序列。

结论

本研究建立了一个快速、灵敏且单碱基分辨率的CRISPR/Cas14a-SNPT基因分型平台，并通过sgRNA工程显著提高了等温CRISPR反应的区分性能。使用了一种截短的Cas12f1_ge4.1 sgRNA（op-sgRNA），显著增强了荧光信号强度和反应动力学。在此基础上，进一步在op-sgRNA的间隔核心区域引入了精细的错配工程，从而提高了snRNA-SNP的区分能力。

CRediT作者贡献声明

Luwei Chai：撰写——原始稿件，方法论。Xinge Cui：验证，数据管理。Qisi Xu：研究，数据管理。Chenxi Li：项目管理，方法论。Yong Xie：验证，软件。Keya Tong：项目管理，研究，数据管理。Tao Le：撰写——修订与编辑，监督，方法论。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了重庆市教育委员会科技研究计划（编号：KJQN202400561）、重庆市教育委员会研究生科学研究与创新项目（编号：CYB240232）以及重庆市医学科学研究项目（重庆市卫生委员会和科学技术局联合项目（编号：2026MSXM013）的支持。

Luwei Chai|Xinge Cui|Qisi Xu|Chenxi Li|Yong Xie|Keya Tong|Tao Le

中国重庆师范大学生命科学学院，重庆动物生物学重点实验室，重庆，401331