热增强型非典型次优 PAM 依赖的 CRISPR/Cas12a 扩增用于检测 BCR1 型 PML::RARα 融合基因和 L217F 突变

《Biosensors and Bioelectronics》：Thermal-enhanced atypical suboptimal PAM-dependent CRISPR/Cas12a amplification for detecting BCR1-Type PML::RARα fusion and L217F mutation

　　

摘要

当前临床方法在检测低丰度PML::RARα融合和耐药性单碱基突变方面面临重大挑战，突显了对快速、高灵敏且成本效益高的遗传检测方法以诊断急性早幼粒细胞白血病的迫切需求。CRISPR/Cas12a系统已成为核酸检测中的革命性工具。然而，其应用常受限于对邻近间隔物基序（PAMs）的要求。在本研究中，我们证明适度提高温度可增强CRISPR/Cas12a活性，同时允许使用非典型次优PAMs。利用PCR驱动、次优PAM依赖的CRISPR/Cas12a级联反应，我们以0.1 aM的检测限敏感检测了BCR1型PML::RARα融合。该方法有效识别了野生型细胞存在下的低丰度突变细胞，并展示了其在检测复发急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病样本中的效力。此外，我们开发了一种检测L217F单碱基突变的敏感方法，采用聚合酶链反应、连接酶链反应和CRISPR/Cas12a的级联策略，在各种野生型DNA样本中达到了10 aM的检测限。因此，这些方法对急性早幼粒细胞白血病的快速诊断以及耐药性核酸突变的敏感检测具有相当大的前景。

引言

急性早幼粒细胞白血病（APL）是一种主要由染色体异常驱动的血液系统恶性肿瘤。超过95%的APL病例与一种染色体易位相关，该易位将15号染色体上的早幼粒细胞白血病（PML）基因与17号染色体上的视黄酸受体α（RARα）基因融合，产生PML::RARα融合转录本和蛋白（de Thé等，2017）。融合转录本主要存在三种亚型，由PML基因上的断点簇区域（BCRs）定义：BCR1（长型，L-form）、BCR2（变异型，V-form）和BCR3（短型，S-form）（Huang等，2024）。在这些亚型中，BCR1最常见，约占病例的50%-78%（Daver等，2020）。虽然这种融合基因通常对三氧化二砷（ATO）等疗法敏感，但APL的管理仍面临微小残留病（MRD）的挑战（Ma等，2022；Sanz等，2019；Walter，2024）。若缺乏持续监测和有效清除，MRD可能导致疾病复发。此外，一些患者可能因PML::RARα融合基因内的单核苷酸变异而发展为治疗耐药性（Mas等，2022；Yokoyama，2024）。值得注意的是，诸如L217F等错义突变经常观察到，并损害ATO与PML结构域的结合，从而抑制癌蛋白降解（Dubey等，2024；Jaffray等，2025）。因此，可靠地检测残余PML::RARα融合基因以进行MRD监测以及与耐药性相关的点突变，对于APL的预后评估和治疗策略优化至关重要。

目前，APL的临床诊断主要依赖于荧光原位杂交（FISH）（Zhao等，2019）和流式细胞术免疫表型分析（FCI）（Weng等，2023），主要用于初始诊断时的细胞遗传学和免疫表型特征分析。分子确证通常采用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）（Wang等，2019）和Sanger测序（Osumi等，2018）。然而，这些传统方法在MRD监测期间检测微量融合基因时通常灵敏度不足，对低丰度耐药点突变的鉴别特异性也不够充分（Baer等，2016；Selim和Moore，2018）。相比之下，下一代测序（NGS）（Simonin等，2024）和数字PCR（ddPCR）（Yuan等，2019）具有卓越的解析灵敏度和特异性。然而，这两种方法需要复杂的样本制备、相对较高的成本和专业技术人员，限制了它们在快速检测和即时检测应用中的适用性。这种挑战在资源有限的环境中尤为明显。因此，迫切需要开发高灵敏度检测技术，能够识别微量低丰度目标DNA，从而实现有效的MRD监测和APL患者耐药性的早期检测。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关（Cas）蛋白构成古细菌和细菌中的适应性免疫防御系统，已发展成为基因编辑和分子诊断的革命性工具（Knott和Doudna，2018；Villiger等，2024）。在该系统中，CRISPR相关RNA（crRNA）引导Cas蛋白识别互补的核酸目标。凭借其高序列特异性和目标激活的核酸酶活性，CRISPR/Cas系统已成功应用于体外核酸检测（Li等，2024）。在第二类CRISPR/Cas系统中，Cas12a对于DNA生物传感特别有吸引力。当识别crRNA引导的双链DNA（dsDNA）目标时，Cas12a不仅切割目标序列，还表现出对单链DNA报告探针的强力附带（反式）切割（Wang等，2025；Yamano等，2016）。通过利用这种反式切割活性处理信号探针，可以将目标核酸的存在转化为可量化的检测信号。CRISPR/Cas12a与各种核酸扩增策略的结合已促成多样化诊断平台的发展，显著提高了核酸检测的敏感性和适用性（Wang等，2026；Xu等，2022；Zheng等，2024）。

尽管具有诊断潜力，CRISPR/Cas12a系统的应用仍受到邻近间隔物基序（PAM）需求的实质性限制。Cas12a通常通过规范的TTTV PAM识别dsDNA目标。然而，许多与疾病相关的目标区域，如融合连接处或点突变，在所需识别位点附近缺乏适当的规范PAM，从而限制了目标位点的选择（Collias和Beisel，2021）。为了克服PAM依赖性，已提出几种策略，包括引入人工PAM位点（Yan等，2022）、探索次优PAMs（Lu等，2022）和设计PAM非依赖探针（Lu等，2022）。例如，Maity等人通过将规范PAM序列纳入环介导等温扩增（LAMP）引物来检测PML::RARα融合基因（Maity等，2025）。Wang等人通过滚环扩增（RCA）产生单链DNA，从而规避通常与双链DNA相关的PAM识别需求（Wang等，2024）。然而，这些方法通常需要严格的目标区域筛选和精细的探针设计，阻碍了简单且广泛适用检测平台的开发。最近，Tian等人报告称适当提高温度可增强由非规范PAM介导的Cas12a反式切割活性，从而减少CRISPR/Cas12a的PAM依赖性，通过这种简单修改，可以开发通用核酸检测系统（Tian等，2026）。虽然这种策略对检测SARS-CoV-2和HPV等外源性病原体有效，但其在临床肿瘤学中的应用面临检测内源性、低丰度遗传变异的挑战，这对解析灵敏度构成了独特挑战，特别是对于点突变，需要在过量野生型背景下的特异性。

在本研究中，我们开发了两种温度介导的非典型次优PAM依赖的CRISPR/Cas12a扩增策略，分别用于敏感特异性检测BCR1型PML::RARα融合和L217F突变（方案1）。首先，我们确认适当提高温度可显著增强CRISPR/Cas12a的活性。最佳工作温度确定为45和50 °C，而非传统的37 °C。此外，我们评估了次优PAM依赖的CRISPR/Cas12a在升高温度下的性能，发现非典型次优PAM序列（GGTG、GGGG、GCTG和GCCG）仍能激活该系统。这些结果表明，在适当提高温度可以大幅放宽PAM限制，甚至可能取消对规范PAM序列的需求。利用这一特性，我们分别开发了针对BCR1型PML::RARα融合基因和L217F突变的高灵敏度检测方法。提出的策略表现出优异的灵敏度和特异性，满足了检测微量低丰度DNA突变的需求，并在使用临床样本中成功验证。因此，这种方法为与核酸突变相关的疾病（包括APL和其他恶性血液疾病以及实体瘤）的早期快速诊断提供了相当大的潜力，特别是对于MRD和耐药性突变的辅助检测。

章节摘要

材料与方法

实验详情见补充材料。

提高反应温度可改善次优PAM依赖的CRISPR/Cas12a反应中的信号检测

已有多种利用特异性设计探针的DNA检测策略被报道，以克服CRISPR/Cas12a对PAM的限制。（Lu等，2022；Yan等，2022）。然而，这些方法通常对序列筛选或探针设计提出严格要求。通常，CRISPR/Cas12a的PAM识别主要由前三个核苷酸（TTTV）决定，大多数已报道的研究集中于这些关键位置（Lu等，2022；Tian等，2026）。为了

结论

总之，我们证明将反应温度升高到45-50 °C可增强CRISPR/Cas12a活性并缓解PAM限制，使crRNA设计可以仅关注目标互补性。利用这一概念，我们将非典型次优PAM依赖的CRISPR/Cas12a与PCR扩增结合以检测BCR1型PML::RARα融合，达到0.1 aM的检出限。该方法在30分钟内以1/10000的分辨率识别低丰度突变细胞并证明

CRediT作者贡献声明

Lu Tai-Cheng：撰写——初稿，可视化，验证，正式分析，数据整理。Tian Hui-Yun：撰写——初稿，验证，调查，正式分析。Zuo Si-Yi：撰写——初稿，验证，调查，正式分析，数据整理。Lin Chen-Han：调查。Lei Yun：撰写——审阅与编辑，资源，经费获取，正式分析，数据整理。Liu Ai-Lin：撰写——审阅与编辑，监督，资源，项目管理，

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文报告工作的财务利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到福建省科技创新联合基金（2024Y9111）、国家临床重点专科建设项目（2021-76）、福建省血液恶性肿瘤临床研究中心（2020Y2006）、福建医科大学附属协和医院优秀青年博士科研课题（2025XH053）、福建医科大学附属协和医院人才启航基金项目（2024XH024）资助。

Lu Tai-Cheng|Tian Hui-Yun|Zuo Si-Yi|Lin Chen-Han|Lei Yun|Liu Ai-Lin|Li Xin

福建医科大学药学院，福建省纳米生物医学技术高校重点实验室，福州，350122，中国