补体C5a通过招募调节性T细胞促进肝细胞癌中的促瘤免疫

《Cancer Letters》：Complement C5a Fosters Tumor-promoting Immunity by Recruiting regulatory T cells in hepatocellular carcinoma

　　

摘要

激肽释放酶是调节免疫细胞的活性补体成分。然而，其在肝细胞癌（HCC）肿瘤免疫微环境（TIME）中的调控作用仍知之甚少。本研究利用CRISPR/Cas9技术在小鼠肝癌细胞中敲除补体蛋白C3或C5。体内和体外实验均显示，C5敲除可显著抑制小鼠模型中的肿瘤生长。此外，利用C57BL/6J小鼠构建了C5ar1敲除小鼠，并通过质谱和流式细胞术分析皮下肿瘤内的免疫细胞谱。结果表明，C5ar1敲除显著减少了调节性T细胞（Tregs）和M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在TIME中的浸润。相反，以肿瘤杀伤活性著称的效应性CD8⁺ T细胞的浸润则显著增强。在机制上，C5a被证明可通过激活AKT信号通路促进巨噬细胞的M2型极化及趋化因子配体5（CCL5）的表达。进一步研究发现，TAM来源的CCL5是Tregs趋化活性的关键驱动因素。最后，在移植性和自发性肝癌小鼠模型中，阻断C5a/C5ar1轴与PD-1单克隆抗体联合可协同增强抗肿瘤效应。总体而言，这些发现揭示了癌细胞来源的激肽释放酶C5a在促进肝脏肿瘤组织抑制性TIME中的关键作用。阻断C5a/C5ar1轴与免疫检查点抑制剂联用可能是治疗HCC的一种有前景的策略。

引言

肝细胞癌（HCC）是一种起源于消化系统的侵袭性恶性肿瘤。在全球范围内，HCC是最常见的癌症类型第六位，五年生存率仅为22% [1]。近年来，免疫疗法，如针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）、程序性死亡蛋白1（PD-1）及其配体PD-L1的单克隆抗体，彻底改变了癌症治疗方式，在多种恶性肿瘤中产生了显著的治疗获益 [2]。然而，尽管免疫疗法取得了显著进展，HCC患者的总生存率仍然令人难以接受地低 [3]。这凸显了进一步探索HCC肿瘤免疫微环境（TIME）以识别新型、更有效治疗策略的紧迫性 [4]。

补体系统是天然免疫系统的重要组成部分，包括三条激活途径：经典途径、替代途径和凝集素途径。这些途径启动一系列级联反应，导致补体蛋白C3和C5的激活，随后形成膜攻击复合物，标志着补体系统激活的最后一步 [5]。许多研究表明补体激活存在于癌症患者中 [6]、[7]，肿瘤细胞可通过表达CD55和CD59等补体调节蛋白来逃避补体介导的细胞毒性 [8]、[9]。此外，补体激活过程中产生的激肽释放酶C3a和C5a具有强效的炎症作用，包括招募嗜酸性粒细胞、单核细胞和T淋巴细胞 [10]。在近期的研究中，Terry等人报告称，竞争性结合C5aR（C5a受体）可以抑制鳞状细胞癌的发生，同时通过重编程巨噬细胞招募细胞毒性CD8⁺ T细胞来增强紫杉醇的疗效 [11]。类似地，阻断C5aR信号通路可降低趋化因子CXCL16的表达，从而抑制肺癌的骨转移 [12]。该研究团队进一步证实，同时抑制C5a/C5aR1和PD-1信号通路在肺癌模型中产生协同抗肿瘤效应 [13]。然而，补体系统在调节HCC的TIME中的作用仍有待深入探索。

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），可被归类为M1型或M2型巨噬细胞，在肿瘤微环境中发挥着至关重要的作用。TAMs与肿瘤的起始、进展和转移密切相关 [14]。M1型巨噬细胞通过促炎活性和细胞毒性增强抗肿瘤免疫，而M2型巨噬细胞则促进肿瘤进展、血管生成和转移 [15]。先前的研究表明，肿瘤细胞来源的补体C3a通过C3a/C3aR轴促进TAMs的M2极化，导致结肠癌免疫抑制和抗肿瘤效应降低 [16]。同样，补体C5a也被发现可促进结肠癌M2极化并促进远处转移 [6]。此外，活化的uPA⁺巨噬细胞可在局部产生C5a，促进鳞状细胞癌的进展 [11]。尽管已有上述发现，但目前关于TAMs与补体系统在肝癌中相互作用的研究证据仍然有限。

在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9技术阐明肿瘤相关C5通过调控TIME调节HCC进展的作用。利用质谱细胞术（CyTOF）和多色流式细胞术，我们发现阻断C5a/C5aR1轴可显著减少巨噬细胞向肿瘤组织的募集。机制分析显示，该轴通过PI3K/AKT信号通路增强TAMs中CCL5的表达，进而促进肝脏肿瘤中调节性T细胞（Treg）的浸润。此外，我们证明了C5a/C5aR1和PD-1信号通路的联合抑制可协同抑制HCC细胞增殖。

章节片段

患者及HCC组织样本

共收集了复旦大学附属中山医院接受根治性肝切除术患者的118对HCC组织及邻近正常瘤旁组织样本。病理诊断由至少两名病理学家独立确认。利用这些样本制备了组织芯片（TMAs），由上海奥道生物技术有限公司提供。此外，收集了87名患者的血液样本，其中60名为HCC患者，27名为非HCC患者。该

补体C5在体内显著促进肿瘤生长

肝脏是免疫豁免器官，其补体系统状态研究尚不充分。为评估血清补体水平是否反映HCC患者的疾病状态，检测了健康志愿者和肝癌患者体内几种关键血清补体蛋白的水平。两组之间C3、C5或C4水平无显著差异（图S1A–S1C）。同样，作为总血清补体指标的CH50

讨论

TIME由肿瘤组织中浸润的免疫细胞、炎症性细胞因子和酶组成，在不同肿瘤类型间表现出显著的异质性。先前的研究表明，TIME在肿瘤发生、恶性进展以及肿瘤对全身治疗的响应中发挥决定性作用 [30]、[31]。在肝癌中，越来越多的证据表明TIME对肝脏肿瘤进展和治疗敏感性具有关键影响

作者贡献声明

周坚： 监督指导。施英红： 监督指导。黄润： 原创写作、验证、监督指导、软件、项目管理、形式分析、概念构思。楚天豪： 验证、软件、方法学。范佳： 监督指导、概念构思。丁振宾： 监督指导。刘伟仁： 监督指导。高俊： 验证。付秀涛： 监督指导。屈卫峰： 监督指导。方元： 方法学。唐正： 写作–审阅与编辑、监督指导。朱桂琪： 可视化，

未引用参考文献

[34]。

伦理声明

已获所有参与者或其法定代表签署的书面知情同意书，同意参与本研究并发表文章。已遵守参与者的隐私权。

本研究涉及器官或组织捐献者。本研究包含人体生物材料，已获捐献者或其近亲属或法定代表同意用于本研究及文章发表。本研究使用的样本并非来源于死刑犯

利益冲突声明

作者声明不存在潜在利益冲突。

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作者声明不存在潜在利益冲突。

利益冲突声明

作者声明不存在潜在利益冲突。

资金支持声明

感谢国家自然科学基金资助（编号：92042301、82003084、82273387、82403408和82303228）。

资金支持声明

本项目获得了国家自然科学基金资助（编号：92042301、82003084、82273387、82403408和82303228）。

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本项目获得了国家自然科学基金资助（编号：92042301、82003084、82273387、82403408和82303228）。

利益冲突声明

作者声明不存在潜在利益冲突。

致谢

感谢同意进行补体水平血液检测的患者。

黄润|楚天豪|朱桂琪|陶晨阳|屈卫峰|方元|高俊|付秀涛|丁振宾|刘伟仁|周坚|施英红|范佳|唐正

复旦大学附属中山医院甲状腺乳腺外科，上海，中国