综述：连接蛋白介导的癌症核活性调控：直接与间接机制

《Cancer Letters》：Connexin-Mediated Regulation of Nuclear Activity in Cancer: Direct and Indirect Mechanisms

　　

连接蛋白（Connexin）经典上被定义为介导直接细胞间通讯的缝隙连接通道的结构亚基，其失调是多种癌症的公认特征。越来越多的证据表明，连接蛋白可通过缝隙连接介导的信号分子转移以及通道非依赖性功能来调控核活性，从而影响癌症进程。然而，现有证据大多属于观察性研究，这些转录效应的潜在机制尚未被完全阐明。近期研究已开始填补这一空白，包括证明连接蛋白可定位于细胞核并直接影响基因表达的工作。在本综述中，研究人员审视了连接蛋白在癌症中调控核活性的现有证据，涵盖促肿瘤与抑肿瘤双重功能。研究人员讨论了缝隙连接细胞间通讯（GJIC）如何通过离子和信号分子的交换影响核活性，并将其与连接蛋白相互作用、支架功能以及连接蛋白或其截短异构体的核或核周定位所介导的效应加以区分。研究人员提出，连接蛋白以背景依赖方式整合细胞间通讯与胞内信号传导，从而塑造核调控程序，并强调了在充分理解这些机制并实现治疗靶向之前必须解决的关键挑战。

1. 引言

连接蛋白（Connexin）是构成半通道（hemichannel）和缝隙连接通道（gap junction channel）结构基础的跨膜蛋白。它们共享保守的拓扑结构，包含四个跨膜结构域、两个胞外环、一个胞质环以及胞质侧的N端和C端尾部。C端结构域表现出显著的异构体特异性变异，是蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰的主要平台。在连接蛋白家族的21个成员中，这一特征在广泛表达的连接蛋白43（Cx43，由GJA1基因编码）中得到了最充分的表征。连接蛋白寡聚化为六聚体连接子（connexon），转运至质膜后，可形成通透性半通道，或更典型地，与相邻细胞的连接子对接形成缝隙连接通道，允许离子、代谢物及小分子第二信使（如cAMP、三磷酸肌醇（IP₃）、葡萄糖和微小RNA（miRNA））的交换。通过半通道活性和缝隙连接细胞间通讯（GJIC），连接蛋白协调增殖、分化、代谢耦联和应激反应，从而促进细胞稳态和组织水平的有序组织。

连接蛋白在癌症生物学中的作用源于60年前的观察，即GJIC的丧失是恶性转化的特征。此后，开创性研究将连接蛋白表达减少和细胞间耦联受损与失控增殖联系起来，支持连接蛋白通过施加组织层面的生长约束而充当肿瘤抑制因子的模型。尽管这一范式捕捉了早期肿瘤发生的重要特征，但已被证明不足以解释连接蛋白在癌症中复杂且常呈现肿瘤和分期依赖性的作用。连接蛋白表达在恶性组织中并非均匀丢失；相反，在肿瘤进展过程中连接蛋白常被保留、重新表达或重新分布，其存在与促肿瘤特征（如侵袭、转移播散和治疗抵抗）相关。新兴证据表明，这些效应中有许多独立于通过缝隙连接的代谢物交换。连接蛋白，尤其是Cx43，可形成支架复合物或重新定位至胞质，影响激酶、细胞骨架元件和转录因子，从而调控汇聚于核转录程序的信号通路。此外，多项研究已鉴定出定位于核周或核区室的连接蛋白或其截短异构体，尤其在应激条件或恶性转化过程中。本文综述了这些观察结果，并提出连接蛋白依赖性效应最终通过几种相互关联的机制汇聚于核信号传导：通道介导的通讯同步细胞间转录反应；通道非依赖性相互作用影响胞质信号通路进而作用于核转录因子；以及连接蛋白或其片段的直接或核相关活性。阐明这些机制的相对重要性及其与核结局的直接分子联系是该领域的关键挑战，也是本综述的核心焦点。

2. 通道介导的核调控

通过其作为通道蛋白的经典作用，连接蛋白影响不同的转录程序。机制上，GJIC传播多种离子和第二信使，形成同步化激酶级联并汇聚于核转录因子的细胞间通量。例如，GJIC可通透的代谢物cAMP激活蛋白激酶A（PKA），导致cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的核磷酸化以及c-FOS和BCL2等CRE依赖性基因的诱导。cGMP通过蛋白激酶G（PKG）信号影响CREB和β-catenin等转录因子，调控cyclin D1和BAX等细胞周期和凋亡决定因子。cGAMP是另一种GJIC可通透的分子，主要通过STING激活发挥作用，驱动TBK1介导的IRF3磷酸化和干扰素基因的诱导。GJIC介导的调控通路不仅可在癌细胞之间运作，还可异细胞性地在癌细胞与邻近正常细胞之间运作。胞内Ca²⁺通常由IP₃动员，激活钙调磷酸酶驱动NFAT转位及细胞因子表达，同时CaMKK信号汇聚于p53介导的凋亡和NF-κB/AP-1介导的存活转录。此外，活性氧（ROS）的细胞间扩散、谷胱甘肽（GSH）对Nrf2的稳定化、多胺以及气体信使等通路均参与GJIC相关的转录协调。

机制上，Cx26在HeLa宫颈癌细胞中的外源表达通过GJIC依赖的cAMP重新分布抑制转化表型，导致p21和p27的转录上调及细胞周期延迟。Cx26突变体T135A和R75Y可消除这些效应，表明GJIC而非半通道活性是主要驱动因素。Cx43 G138R突变体无法支持cAMP依赖性转录信号。Cx37通过功能性通道活性抑制大鼠胰岛素瘤细胞增殖，孔缺陷突变体Cx37-T154A完全丧失抗增殖能力。在异细胞性微环境中，脑转移性乳腺癌或肺癌细胞与星形胶质细胞通过Cx43介导的GJIC相互作用，促进cGAMP从肿瘤细胞转移至星形胶质细胞胞质，激活STING/TBK1/IRF3通路，触发I型干扰素和肿瘤坏死因子分泌，进而激活肿瘤细胞中STAT1和NF-κB转录程序，上调PD-L1和CXCL10等免疫逃逸和耐药靶点。miRNA的GJIC依赖性转移（如miR-5096从胶质瘤细胞转移至星形胶质细胞）可促进肿瘤侵袭，且Cx43通道的miRNA通透性显著高于Cx30通道。半通道介导的机制在癌症中研究较少，但Cx43半通道介导的ATP释放可激活p38 MAPK并诱导一氧化氮产生，与炎症基因调控相关。

3. 连接蛋白支架和蛋白质相互作用汇聚于细胞核

在缝隙连接通道的经典作用之外，连接蛋白通过复杂的支架功能调控核信号，调节激酶通路和转录调节因子。Cx43因其庞大的C端尾部而成为该领域研究最深入的成员，该尾部作为无序信号枢纽，包含众多磷酸化位点和蛋白质相互作用基序。Cx43-CT相互作用组包括Src、PKC、MAPK和酪蛋白激酶1等关键激酶，以及ZO-1和β-catenin等结构和信号支架。Cx43的266-283残基招募Csk和PTEN以灭活胶质瘤细胞中的c-Src，稳定PTEN并抑制PI3K/Akt和FAK信号。在乳腺癌细胞中，Cx43在质膜上隔离β-catenin，抑制Wnt驱动转录；Cx43表达缺失增强核β-catenin活性。然而在结直肠癌中，Cx43直接结合β-catenin并与其共转位至细胞核。Cx43竞争性结合微管，释放被锚定的Smad2/3，使其在TGF-β刺激下与Smad4转位至细胞核驱动转录；Cx43模拟肽JM2可破坏该相互作用并减少胶质母细胞瘤干细胞存活。Cx43还作为分子锚将转录调节因子CCN3保留在膜上，限制其核定位。在胶质瘤中，胞内Cx43通过WNK1-c-Myc信号轴驱动促肿瘤干细胞表型。Cx43与p27竞争结合Hsc70，干扰cyclin D1-CDK4-p27复合物的核转位；Cx43-CT还结合Skp2并促进其降解，阻止p27泛素化，稳定游离p27单体以抑制核cyclin E-CDK2复合物。在内皮细胞中，Cx37隔离活化的ERK，稳定核ERK靶标Foxo3a，促进p27转录并诱导细胞周期停滞。多种连接蛋白调控β-catenin活性：Cx32缺失与β-catenin核积累相关；Cx50通过稳定β-catenin-E-cadherin复合物限制TGF-β2诱导的上皮-间质转化（EMT）；胃癌中胞质Cx26与β-catenin相互作用阻止其核转位。在胰腺癌中，Cx26通过与c-Myc竞争结合PSMD2的Armadillo样螺旋结构域，保护c-Myc免受蛋白酶体降解，维持其核转录活性。

4. 连接蛋白的直接和核相关功能

连接蛋白或其衍生片段物理进入核区室并直接发挥作用的可能性已获得越来越多的证据支持。癌基因驱动的转化研究表明，src和neu转化的细胞中Cx43部分定位于细胞核，提示核转位是癌基因特异性事件。应激诱导的S279/S282磷酸化异构体、S255磷酸化Cx43以及S368磷酸化Cx43均可表现出核定位。乙酰化也被鉴定为Cx43核输入的驱动因素。Wnt5A和Wnt9B处理可使核Cx43增加8-10倍。抗有丝分裂药物灰黄霉素破坏Cx43-微管关联并促进Cx43核转位。GJA1 mRNA可通过内部翻译起始产生多个N端截短异构体，其中GJA1-20k在多种肿瘤细胞中高表达，通过与基础转录因子3（BTF3）相互作用转位至细胞核，并与RNA聚合酶II结合调节N-cadherin表达；GJA1-11k优先定位于细胞核并抑制细胞周期进程。Cx43-CT中预测的核定位信号（NLS）经实验验证可与importin-α/β复合物相互作用，Ran和KPNB1的相互作用已通过免疫沉淀和质谱确认。全长Cx43可通过importin-β依赖性途径定位于核膜并组装为功能性六聚体通道。另一种途径涉及"搭便车"运输：在A549肺癌细胞G1晚期，AKAP95与Cx43协调促进cyclin D1和E1的核转位，核内Cx43-AKAP95复合物与DNA共定位以调节染色质聚集和G1/S转换。Cx43也可与β-catenin形成复合物共转位至细胞核。在黑色素瘤中，核Cx43的定位受SUMO化和磷酸化调节，通过与LMNA、HMGB1及多种DNA损伤反应（DDR）相关复合物在核纤层相关结构域（LAD）的相互作用，延迟并干扰DDR，损害同源重组（HR），偏向易错的非同源末端连接（NHEJ）和替代末端连接（Alt-EJ）通路，促进基因组不稳定。细胞外囊泡包裹的全长Cx43可重新敏化耐药肿瘤对BRAF/MEK抑制剂的反应。临床标本中，肺腺癌亚群中强核Cx43表达与较差总生存期相关；结直肠腺癌中Cx43核积累与晚期疾病和不良临床结局相关；胶质瘤中核Cx43定位与组织学分级无关，但主要见于白细胞浸润区域。Cx46可定位于细胞核并直接结合启动子和基因间区DNA，其截短异构体GJA3-30k经分子动力学模拟提示可形成RAD50样二聚体结构，可能形成稳定DNA复合物。在发育中的耳蜗中，Cx26定位于细胞核并占据转录起始位点。在三阴性乳腺癌（TNBC）中，Cx26在核膜胞质面与NANOG和FAK形成三元复合物，稳定NANOG并支持肿瘤球自我更新；Cx26衍生细胞穿透肽靶向RYCSG基序可降低核NANOG和FAK，下调NANOG靶基因并抑制肿瘤生长。

5. 癌症中的连接蛋白-转录轴：前景与障碍

本综述讨论的证据支持连接蛋白介导的癌症核调控分层模型，通过三种相互关联的机制运作：GJIC依赖性细胞间信号传导、通道非依赖性支架和信号功能，以及由连接蛋白片段、内部翻译异构体或在特定背景下由全长蛋白介导的直接核相关活性。这些机制并非冗余，而是在不同空间和时间尺度上发挥作用，汇聚于转录调控、染色质组织、细胞周期进程、应激适应和DDR的调节。GJIC介导的离子、代谢物、第二信使和氧化还原相关信号转移在组织水平协调相邻细胞间的核反应，有助于约束转录异质性并同步化对增殖或环境应激信号的响应。在单细胞水平，连接蛋白支架功能将膜相关事件转化为汇聚于转录因子和染色质相关调控程序的胞内信号输出。叠加在这些机制之上的是涉及连接蛋白衍生核或核周物种的第三层，其可能直接影响转录调控。在特定背景下，这些活性在机制上相互关联：Cx43-CT在N-cadherin启动子处的结合促进与EMT相关的转录程序；膜定位Cx43的伴随缺失增强核β-catenin积累，从而强化这些EMT相关转录状态。相比之下，在结直肠癌中，TGF-β驱动的Cx43水平升高可刺激Cx43和β-catenin作为复合物共同核转位。这些观察结果共同反对连接蛋白在癌症中具有单一统一作用模式的观念，支持一种背景依赖性的整合模型。