BODIPY-赖氨酸缀合物用于精细可调的蛋白质和脂质体靶标检测

《Dyes and Pigments》：BODIPY-lysine conjugates for finely tunable sensing of protein and liposome targets

　　

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  BODIPY偶联物的荧光对赖氨酸胺的修饰敏感
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  赖氨酸游离胺类似物的两性离子二聚作用淬灭了BODIPY发射
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  仅与BSA结合会显著影响荧光；不与dsDNA结合
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  芘-BODIPY用于宽范围蛋白质传感，芴-BODIPY用于脂质体膜探针
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  低细胞毒性，且细胞摄取效率高，在细胞器内有效分布

引言

BODIPY染料[1]是研究最为广泛的荧光团家族之一，这归因于其优异的谱学和光物理性质，包括高荧光量子产率（Φ_f）和大摩尔吸收系数（ε > 50000 M^-1 cm^-1）[2]，这些性质可通过简单的结构修饰轻松调节[3]。其高热稳定性和光化学稳定性、在许多有机溶剂中的良好溶解性、在可见光区域的激发和发射以及具有高峰强度的窄发射带，使其被广泛应用于抗癌光疗[4]、材料科学[5]和荧光显微镜[6]，包括荧光传感[7]以及在生物系统中用作荧光标记物[8]。其多功能性源于引入可定制反应基团和调节发射光谱的可能性，使其成为各种生物和生化应用中最有用的现代荧光团之一[8,9,10,11]。

BODIPY衍生物已被引入非天然氨基酸的结构中[12,13,14]。此外，各种策略已被用于将染料共价连接到蛋白质上。胺反应性BODIPY衍生物（如NHS-Ph-BODIPY）通过氨基与蛋白质结合，为蛋白质可视化提供明亮稳定的荧光[15]。蓝发射的8-氨基BODIPY衍生物通过酰胺键形成或硫醇-烯偶联，可在温和条件下实现蛋白质标记，适用于蛋白质动力学研究和基于FRET的测定[16]。此外，蛋白质特异性BODIPY探针，如基于绿色BODIPY的二马来酰亚胺衍生物，允许在活细胞中实现对基因标记蛋白质的选择性荧光原标记[17]。另外，肼基官能化的BODIPY探针能够高灵敏度地检测羰基化（氧化损伤）蛋白质，并用于近红外荧光细胞成像[18]。结合放射性同位素的双功能BODIPY标记剂，如放射性碘化BODIPY-NHS衍生物，可实现蛋白质和多肽的荧光成像和单光子发射计算机断层扫描（SPECT）[19]。

我们之前的研究表明，用光化学反应活性醌亚甲基前体取代的BODIPY染料（如I，图1） undergoes 波长依赖的光化学反应，并且在350 nm激发时共价结合到牛血清白蛋白（BSA）上[20,21]。我们还开发了用于选择性染色线粒体等细胞内细胞器的BODIPY衍生物（II，图1）[6]。这些化合物含有BODIPY核心，在meso-位置用决定亚细胞定位的基团取代：吗啡啉基团靶向溶酶体，磺酰胺基靶向内质网（ER），三苯基膦鎓基团通过三唑连接用于线粒体靶向[6]。此外，我们设计并研究了由非天然丙氨酸和酪氨酸组成的二肽（III，图1），其特征为良好的荧光性质、光化学反应活性以及与DNA/RNA的生物学相关亲和力，使复杂物在光激发下能够实现对寡核苷酸的荧光标记[22]。

文献中已描述了几种靶向赖氨酸的BODIPY类似物。例如，3,5-二氯-氮杂BODIPY被开发为细胞中赖氨酸检测的探针[23]。BODIPY类似物V（图1）已通过将荧光标记的赖氨酸掺入核糖体上延伸的多肽链中来监测生化过程[24]。能够进行逆电子需求Diels–Alder反应的BODIPY衍生物已被应用于监测活细胞中蛋白质的苯甲酰化翻译后修饰[25]。最近开发的含有赖氨酸的BODIPY衍生物（VI，图1）显示出抗菌活性并在溶酶体贮积症的细胞模型中具有潜力[26]。另一种探针THBPY能够在水相中以纳摩尔浓度检测赖氨酸，通过形成稳定的亚胺键并伴随颜色和荧光变化来实现[27]。由BODIPY和赖氨酸-肼基单体组成的动态双联体（BDPLys）被开发用于通过pH响应性降解来控制BODIPY荧光，从而实现对细胞内聚合物降解的监测[²⁸]。此外，商业可用的染料BODIPY-FL-AA[29]因其稳定性、亮度和与生物系统的兼容性，被广泛用于蛋白质和多肽标记、多肽追踪[30,31,32,33,34]以及基于荧光的测定[35,36,37,38]。在探针或引物标记过程中，可通过与独特定位的鸟嘌呤相互作用发生荧光淬灭，从而实现对特定DNA或RNA分子的定量分析。许多报道的偶联物含有BODIPY在芳香体系的meso-位置被取代，这通常易于通过合成获得[[2], [3]]。最重要的是，此类衍生化可以显著影响电子性质[39]，并且可能促进细胞摄取[39]。

在本工作中，我们报道了BODIPY–赖氨酸偶联物以及含有两个荧光团（BODIPY和芘或芴）的探针的合成和光物理表征（图1）。这些化合物的设计（图1，1–6）受到先前报道的能够共价结合半胱氨酸的BODIPY蛋白质标记物（IV，图1）[11,40,41]以及靶向线粒体的BODIPY类似物（II，图1）[6]的启发。我们的目标是开发最简单的单氨基酸–BODIPY偶联物，用于生物大分子传感和生物成像应用。为此，我们构建了一系列化合物，其中在meso-苯酚上带有炔丙基团的BODIPY单元[6]通过通用的点击反应连接到由赖氨酸的两个氨基（α-或ε-氨基）衍生而来的叠氮化物上（图1和Scheme 1，化合物1-4）。这一原理证明为未来开发针对NH₂的肽或蛋白质标记的高效方案奠定了基础。此外，受赖氨酸作为两种互补荧光团载体以研究分子内相互作用的启发[42]，我们制备了BODIPY/芴和BODIPY/芘类似物（图1和Scheme 1，化合物5、6）。这一系列的谱学性质研究以及它们与DNA、蛋白质和脂质膜的相互作用，依赖于比较带有质子化氨基的化合物（3、4）与氨基上含有脂族（1、2）或芳族（5、6）取代基的类似物。此外，两种带有芳族取代基的类似物（5、6）在芳族表面积、荧光性质和对生物大分子的内在结合亲和力方面存在显著差异，其中芴通常比芘更为惰性。

对于模型生物大分子，我们选择牛胸腺DNA（ctDNA）作为双链DNA模型，其特征为具有良好定义的B型螺旋结构和平衡的G–C/A–T碱基组成，小沟通常作为小分子的主要结合位点[43,44]。选择牛血清白蛋白（BSA）作为模型蛋白质，因其结构和性质已被充分表征且稳定，适合在模拟生理条件下研究蛋白质–配体相互作用。磷脂POPC（1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱）被用作生物膜的模型，因其形成稳定的流体双层膜，模拟真核细胞膜，允许研究膜相关相互作用[45]。

章节摘要

所研究化合物的合成

赖氨酸衍生的叠氮化物是通过使用咪唑-1-磺酰叠氮盐酸盐（ISA·HCl）在原文献条件下进行重氮转移反应制备的[46,47]。重氮转移试剂也按照先前报道的方法合成[46]。该方法适用于规模化，并且显示出试剂的长期稳定性，使其在合成工作流程中特别有利于重复使用。

叠氮化功能的赖氨酸A–C通过

生物学

所研究的化合物与模型蛋白质牛血清白蛋白（BSA）表现出具有生物学相关性的结合，这可能导致细胞环境中的细胞毒性效应[63]。为调查这种可能性，我们使用比色法（MTT）测定法[64]在72小时内对所有化合物针对HCT116人结直肠癌细胞系进行了抗增殖活性的初步筛选，并以HaCaT正常人表皮角质形成细胞系作为选择性参考（表3）。该

结论

对新合成的BODIPY-赖氨酸偶联物的光谱表征揭示了它们的UV/Vis光谱以及尤其是荧光性质对赖氨酸伯胺基团细微修饰的显著依赖性。游离胺衍生物3和4——仅在游离氨基位置（β- vs. ε-）上不同——表现出高度相似的谱学特征，但与它们的氨基保护类似物形成鲜明对比，显示出近乎完全的淬灭

通用信息

所有化学品和溶剂均为分析纯或HPLC级，购自不同公司：化学品来自Acros Organics、Sigma Aldrich或TCI，溶剂来自Fisher Scientific或Macron。溶剂THF、乙酸乙酯和二氯甲烷在使用前进行了额外蒸馏。盐酸为36% w/w（Sigma Aldrich）。化合物名称使用ChemDraw Professional（版本20.0.0.41）生成，遵循IUPAC惯例。反应通过薄层

CRediT作者贡献声明

Nikola Basari?: 写作 – 审阅与编辑，验证，监督，资金获取。Ivo Piantanida: 写作 – 审阅与编辑，监督，资金获取，形式分析，概念设计。Lidija Uzelac: 调查。Marijeta Kralj: 监督，数据整理。Mladena Glava?: 写作 – 初稿，调查。Dijana Pavlovi? Safti?: 写作 – 初稿，调查，形式分析

资金

本研究由克罗地亚科学基金会项目HrZZ IP-2022-10-9829和IP-2024-05-8565资助。

利益冲突声明

? 作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

D. P. S. 感谢生物胶体与表面化学实验室（鲁德·博斯科维奇研究所物理化学部门）成员提供Zetasizer Nano ZS（Malvern）的使用。

Mladena Glava?|Dijana Pavlovi? Safti?|Lidija Uzelac|Marijeta Kralj|Nikola Basari?|Ivo Piantanida