活体内ECOD-Sed检测法：一种测定底栖生物细胞色素P450活性的优化方法

《Environmental Pollution》：The in vivo ECOD Sed assay: an optimised method for measuring cytochrome P450 activity in sediment-dwelling organisms.

　　

## 摘要

细胞色素P450（CYP450）酶在外源化合物（异源物）的生物转化中起着核心作用，然而传统的基于水的体内乙氧香豆素-O-脱乙基酶（ECOD）检测方法并非适用于食碎屑动物的有效方法。我们通过将沉积物同时纳入预暴露和检测阶段，开发并验证了一种沉积物整合式体内检测方法——ECODSed。ECODSed反映了食碎屑动物在摄食过程中暴露于沉积物关联污染物时的环境相关暴露途径。在评估体内ECOD活性之前，我们评估了代表不同预暴露场景的三种检测格式：ECODSed14（14天预暴露）、ECODSed7（7天预暴露）和快速ECODSed（无预暴露）。我们发现，CYP诱导剂如多氯联苯（PCBs）和多环芳烃氟蒽（FLUO）在ECODSed14中经过14天后（约55%，PCB）以及ECODSed7中经过7天后（约129%，FLUO）对ECOD活性产生了最强的诱导作用。在ECODSed7和ECODSed14中，抗抑郁药舍曲林（SER；CYP抑制剂）均持续产生低于对照组的活性（平均约30%）。在快速检测中，舍曲林显著抑制了活性（约50%），而氟蒽与对照组相比无偏差。总体而言，ECOD活性的层次关系为：氟蒽 > PCBs > 对照组 > 舍曲林。我们的结果表明，ECODSed能够可靠地捕捉体内不同暴露时长下的化学特异性代谢动力学。

综上，三种ECODSed检测建立了一个分层框架，使用户能够匹配检测时长和复杂度。快速检测提供化学调节因子、物种反应和底物适用性的快速筛选；ECODSed7捕捉早期诱导动力学；ECODSed14揭示长期暴露下的持续代谢反应。ECODSed推进了沉积物栖息生物中CYP450介导活性的评估，实现了快速评估和对污染物效应的深入机制洞察。

## 引言

底栖生物通过摄食受污染的颗粒物和有机质以及通过孔隙水和上覆水中的溶解性物质暴露于沉积物关联的疏水有机化学品（HOCs）（Lamoureux and Brownawell, 1999; Dai等, 2012）。随着疏水性的增加，HOCs优先分配至沉积物中，使沉积物摄食和食物摄入成为沉积物栖息生物的主要暴露途径（Selck等, 2003a）。对于log Kow ≥ 5.5的化合物，沉积物摄食被认为是食碎屑动物的主要吸收途径（Fowler等, 1978; Klump等, 1987; Selck等, 2003b）。

在外源化合物暴露后，生物体启动解毒过程，其中主要由细胞色素P450（CYP450）酶介导的I相生物转化在将疏水污染物转化为亲水、更易排泄的代谢物方面起着核心作用（Livingstone, 1989; Zhao等, 2021）。CYP450活性的变化被广泛用作化学暴露的指标（Gottardi等, 2016; ács等, 2024），尽管大多数现有评估依赖于体外检测方法，测量浮游物种中乙氧基苯酚-O-脱乙基酶（EROD）或乙氧香豆素-O-脱乙基酶（ECOD）活性。体外酶活性测定（EEAs）利用选择性外源化合物底物，如7-乙氧基香豆素或乙氧基苯酚，这些底物可被生物体轻易吸收，随后由I相细胞色素P450酶代谢。这些底物在CYP介导的氧化反应下形成荧光代谢物（如7-羟基香豆素或羟基苯酚），其荧光强度与浓度成正比。

荧光的时间变化因此提供了CYP依赖性生物转化速率的定量度量，整合了能够将母体底物转化为对应代谢物的一组CYP亚型的活性。重要的是，这些检测方法选择性地反映I相氧化代谢，因为荧光代谢物的形成严格由CYP单加氧酶催化。II相结合产物（如葡萄糖醛酸或硫酸盐）不被检测到，因为随后的结合反应不产生荧光信号，从而超出这些检测方法的分析范围（Binelli等, 2006; Gagnaire等, 2010; Le Bihanic等, 2013）。此外，由于底物本身可诱导或激活CYP酶，即使仅暴露于7-乙氧基香豆素的对照组中也可能观察到生物转化活性的增加，从而提供了基线I相CYP活性（Waxman and Chang, 2006）。

尽管具有生态相关性，但水生无脊椎动物——尤其是沉积物栖息物种——中CYP介导的代谢仍然了解不足。目前的体内研究仅限于少数物种，且主要研究水体暴露（Noort等, 2025），沉积物暴露条件下的代谢研究在很大程度上仍未被探索。体内ECOD和EROD方法在各种水生生物中的进展（包括腹足类、鱼胚胎、大型蚤、摇蚊和扁虫）使得能够实时评估目标CYP活性（Gagnaire等, 2010; Le Bihanic等, 2013; Gottardi等, 2016; Li, 2016）。例如，Gottardi等（2016）开发了一种基于CYP介导的7-乙氧基香豆素转化为荧光代谢物7-羟基香豆素的体内ECOD检测方法。该化合物由多个CYP亚型代谢，主要在CYP1、CYP2和CYP3家族中，这些家族在外源化合物生物转化中是关键群体（Nebert and Russell, 2002; Waxman and Chang, 2006; Doelle等, 2009; Rendic and Guengerich, 2015; Loerracher and Braunbeck, 2021）。然而，现有的体内ECOD检测方法仅适用于水体暴露，无法评估沉积物栖息生物中沉积物关联HOCs的食物摄入。为解决这一差距，我们开发了一种新型体内沉积物CYP检测方法ECODSed，旨在测量沉积物摄食过程中作为CYP依赖性I相生物转化代理指标的实时体内ECOD活性。需要注意的是，ECOD活性反映的是能够代谢7-乙氧基香豆素的CYP亚型活性，因此应将其解释为CYP依赖性I相生物转化的代理指标，而非CYP450总活性的度量（Gottardi等, 2016; Noort等, 2025）。

我们针对机会性河口多毛类动物泰来寡毛虫（Capitella teleta）进行了ECODSed检测，该物种在有机富集和受污染的沉积物中繁衍生息（如来自废水排放、水产养殖废物和石油污染）（Blake等, 2009; Forbes等, 2001; Selck等, 2003a, 2003b）。泰来寡毛虫能够代谢PAHs，但具体的生物转化途径尚未完全阐明（Forbes等, 2001; Selck等, 2003a, 2003b）。虽然Hochstein等（2019）的近期工作鉴定出可能与PAH降解相关的肠道微生物分类群，但实验证据表明氟蒽的转化主要需要宿主体本身的存在（Jang等, 2020）。泰来寡毛虫基因组中多个CYP基因的存在（Li等, 2004; Dejong and Wilson, 2014）进一步支持了将其作为沉积物关联外源化合物代谢评估模型的适用性。

为验证ECODSed，我们将泰来寡毛虫暴露于亲水性CYP抑制剂（即戊唑醇）和三种代表性HOCs：舍曲林（弱CYP抑制剂）、氟蒽（高度可生物转化且为CYP诱导剂）以及PCBs（生物转化能力差但为CYP诱导剂）。通过这种方式，我们旨在建立一种生态现实的工具来量化沉积物栖息生物中的ECOD活性，并推进对沉积物关联污染物如何影响底栖代谢反应和耐受机制的理解。

## 试剂片段

### 化学品和ECOD溶液

戊唑醇（CAS: 60207901；纯度≥98%）购自Sigma Aldrich，溶解于乙腈（Merck；CAS: 75058；纯度99.9%）中制备母液。选取三种PCB同系物作为代表性遗留污染物：PCB 52（CAS: 35693993）、PCB 153（CAS: 35065271）和PCB 209（CAS: 2051243）。PCB 52和PCB 153（Th. Geyer Skandinavien，丹麦）溶解于丙酮（Merck 1.00014；CAS: 67641；纯度99.9%）中，而PCB 209（Sigma Aldrich）溶解于

### 基于水的ECOD不适合用于测量泰来寡毛虫的ECOD活性

初步尝试在仅用水条件下将体内ECOD检测方法应用于泰来寡毛虫时，未能显示可靠的ECOD活性信号。检测读数和仅用水的预暴露设置均无法检测泰来寡毛虫中ECOD活性的调节（Noort等, 2025）。这促使我们开发了一种在检测中整合沉积物的方案（ECODSed）。

### ECODSed14

ECODSed14的结果显示，所有处理组的ECOD活性均随时间增加（图1a），但两者均

在体内ECOD检测中引入沉积物是检测泰来寡毛虫中ECOD活性调节的关键变革性要素

初步尝试在仅用水条件下将体内ECOD检测方法应用于泰来寡毛虫时，未能产生一致的ECOD活性信号（见Noort等, 2025）。可能的解释可能与生物学和方法学因素均有关：泰来寡毛虫在缺乏沉积物（即仅用水）条件下保存时会表现出应激症状，这可能损害代谢功能（Hand and Hardewig, 1996; Sokolova等, 2012），使基于水的ECOD检测不那么可靠。此外，泰来寡毛虫是一种

## 结语

ECODSed和快速ECODSed为评估沉积物栖息生物中CYP依赖性I相生物转化提供了一个有前景的框架。其灵活性使这些检测方法适用于污染物筛选、机制研究，以及作为未来风险评估应用的辅助工具（在进一步验证后），可在有或无预暴露条件下以及毒性测试的不同阶段使用。将沉积物暴露纳入大大增强了生态相关性，反映了自然的

### CRediT作者贡献声明

Elettra D'Amico：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，方法论，调查研究，形式分析，概念构思。Henriette Selck：撰写——审阅与编辑，监督，资金获取，形式分析。Ghaliya Al Noaimi：撰写——审阅与编辑，方法论。Wing Sze Chan：撰写——审阅与编辑，调查研究。Kevin Noort：撰写——审阅与编辑，调查研究，形式分析。Martina Santobuono：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿

### 未引用参考文献

Casarett, 2019; Huddart等, 2020a; Livingstone等, 1989。

### 伦理声明

不需要伦理委员会批准。

### 生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的声明

在准备本工作期间，作者使用了Copilot-Microsoft来提高稿件的可读性。在使用该工具/服务后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对已发表文章的内容承担全部责任。

### 资金

本工作由CHRONIC项目"驱动化学品环境风险的慢性暴露场景"资助，该项目是欧洲联盟地平线2020研究和创新计划下玛丽·斯克洛多夫斯卡-居里行动（MSCA）资助的创新培训网络（ITN）；资助编号956009。此外，本工作由欧洲硅酮中心（CEH）资助（项目编号02/444/S040/07/0280）。

### 利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/人际关系：Elettra D'Amico报告获得欧洲硅酮中心（CEH）的资金支持。Martina Santobuono报告获得欧洲联盟的资金支持。如有其他作者，声明他们没有已知的竞争性财务利益或可能影响本文报告工作的个人关系。

### 致谢

作者感谢Michele Gottardi和Nico van den Brink提供的宝贵意见，他们的见解改进了本研究。

Elettra D'Amico | Martina Santobuono | Kevin Noort | Wing Sze Chan | Ghaliya Al Noaimi | Henriette Selck

丹麦罗斯基勒大学科学与环境系