双氰胺-酚酸组合在盐碱化稻田土壤中增强对硝化作用及氧化亚氮排放的抑制：整合微生物与代谢证据

《Environmental Technology & Innovation》：Enhanced suppression of nitrification and nitrous oxide emissions by dicyandiamide-phenolic acid combinations in saline-sodic paddy soils: Integrated microbial and metabolic evidence

　　

盐碱化稻田土壤中较低的氮素利用效率及氧化亚氮（N₂O）释放仍是可持续氮管理面临的重要挑战。本研究在受控好氧条件（25 ℃，60%持水量）下开展微宇宙培养试验，评估了双氰胺（DCD）、三种酚酸及其组合的效应，并采用定量PCR（qPCR）、功能基因扩增子测序和代谢组学方法解析硝化抑制与N₂O减排机制。在所有处理中，双氰胺-苯甲酸组合（DCDBA）表现出最强的硝化抑制效果，硝化抑制率达58.2%，并将硝态氮（NO₃^--N）累积量从19.1 mg kg^-1降至7.9 mg kg^-1。此外，复合硝化抑制剂还使氨氧化细菌（AOB）amoA和hao基因丰度显著降低75.1%–97.7%，表明其抑制了与硝化相关的功能潜力。微生物与代谢组学分析进一步表明，DCDBA与氨氧化菌及反硝化菌相关群落的调整，以及氮同化、细胞应激适应和抑制剂转化相关的代谢响应有关。同时，共现网络分析证实DCDBA塑造了更复杂、稳定且模块化的微生物网络。偏最小二乘路径模型（PLS-PM）分析表明，总N₂O排放的降低既与硝化基因的直接抑制相关，也与反硝化过程的调控相关。这些结果表明，在试验条件下，DCD-酚酸组合能够抑制盐碱化土壤中的硝化作用，并为未来时间分辨及田间尺度研究中待验证假说的提出提供了依据。

**论文解读：双氰胺-酚酸组合在盐碱化稻田土壤中的硝化抑制与N₂O减排机制**

**1. 研究背景与问题**

全球氮肥施用量持续增加，但作物平均氮素利用效率（NUE）仍显著低于50%，常规施肥导致50%–70%的施氮量损失，进而引发水体富营养化、硝酸盐淋洗和温室气体N₂O排放。农业土壤约占全球人为N₂O排放的50%，预计到2030年还将增加15%。氮损失主要通过硝化和反硝化过程发生：硝化由氨氧化古菌/细菌（AOA/AOB）经氨单加氧酶（AMO）驱动，亚硝酸盐氧化细菌（NOB）参与后续步骤；反硝化则由亚硝酸盐还原酶（nirK/nirS）和氧化亚氮还原酶（nosZ）将硝酸盐逐步还原为N₂O和N₂。在松嫩平原，盐碱化土壤被大量开垦为稻田，但高pH、高盐分和波动的水分条件会扰乱氮循环，加速铵氧化、促进硝酸盐淋洗并放大N₂O排放，从而降低NUE。化学硝化抑制剂（CNIs）如双氰胺（DCD）等虽能抑制硝化，但其效果受环境条件影响大、稳定性差；植物源生物硝化抑制剂（BNIs）如酚酸类物质则存在对AOB和AOA的相反效应，机理不确定。因此，将化学与生物抑制剂组合成复合硝化抑制剂，可能通过同时靶向硝化-反硝化级联的多个节点产生协同效应，但其在盐碱化胁迫下与土壤微生物组的互作机制尚不清楚。本研究旨在评估DCD与三种酚酸组合对盐碱化稻田土壤氮转化的影响，并解析其微生物与代谢调控机制。

**2. 研究技术与方法**

研究人员采集吉林省松原市10年树龄的盐碱化稻田土壤（变性土，pH 8.6，EC 0.4 dS m^-1），在25 ℃、60%持水量的好氧微宇宙中培养14天，设置8个处理：对照（CK）、单施咖啡酸（CA）、阿魏酸（FA）、苯甲酸（BA）、单施DCD，以及DCD分别与三种酚酸组合（DCDCA、DCDFA、DCDBA）。所有处理统一施用100 mg N kg^-1的(NH₄)₂SO₄。采用静态箱-气相色谱法测定N₂O排放；KCl提取-流动分析仪测定NH₄⁺-N和NO₃^--N；采用定量PCR（qPCR）和功能基因扩增子测序分析氨氧化（AOA amoA、AOB amoA、hao）和反硝化（nirS、nosZ）功能基因丰度及群落组成；利用LC-MS/MS非靶向代谢组学分析土壤代谢物；结合共现网络、Mantel检验和偏最小二乘路径模型（PLS-PM）进行多变量统计。

**3. 主要研究结果**

**3.1 土壤氮组分与硝化作用**
与CK相比，所有抑制剂均显著延缓NH₄⁺-N下降，其中DCD保存铵态氮能力最强。复合抑制剂（尤其DCDFA和DCDBA）最有效地限制了NO₃^--N生成，使其从CK的19.1 mg kg^-1分别降至8.0和7.9 mg kg^-1。仅在单一酚酸处理的前3天出现瞬时NO₂^--N积累。总N₂O排放在CK第3天达到峰值（0.05 mg N₂O kg^-1），而复合抑制剂在整个培养期维持显著较低浓度。DCDBA和DCDFA的硝化抑制率最高，分别为58.2%和57.4%。

**3.2 硝化和反硝化功能基因丰度**
培养结束时，DCD和DCDBA使AOA amoA丰度降低17.9%–27.9%；所有抑制剂均抑制AOB amoA和hao基因，其中复合抑制剂的降幅达75.1%–97.7%。相反，复合抑制剂显著增加了反硝化基因nirS和nosZ的丰度。

**3.3 功能微生物多样性与群落结构**
复合抑制剂显著提高了AOB amoA群落的Shannon和Pielou（E'）指数，但降低了nirS和nosZ群落的α多样性。PCoA显示复合抑制剂处理的群落（尤其AOB amoA、nirS、hao）明显分离。属水平上，AOA优势属Candidatus Nitrosocosmicus被DCD和DCDFA显著抑制；AOB优势属Nitrosomonas被DCD和复合抑制剂显著抑制；hao相关属（Microvirga、Desulfosarcina、Bradyrhizobium）在复合处理中相对丰度降低；而nirS/nosZ携带属（Pseudomonas、Azoarcus、Cupriavidus、Methylobacillus）则被富集。βNTI分析表明，确定性过程主导群落装配，DCDBA增强了对AOA和AOB群落的同质选择，但减弱了对nirS和nosZ群落的同质选择。

**3.4 土壤非靶向代谢组学分析**
PCA显示复合抑制剂形成独特且紧密的代谢簇。共鉴定出15种关键差异代谢物（如Pyrimethamine、Guanylurea、Glu-His等）。KEGG通路富集到丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、维生素B6代谢和阿特拉津降解等与氮循环相关的通路。单施酚酸主要改变Synephrine等代谢物；DCD关联到cyanoguanidine和5,6-dihydro-5-azacytidine；复合抑制剂则显著积累D-Xylulose、Ammeline、Maltotetraose和Raffinose。

**3.5 共现网络分析**
单一抑制剂（CA、FA、DCD）处理导致网络节点和边数减少、拓扑稀疏。DCDBA和DCDFA则维持了中等网络复杂度，其中DCDBA表现出最高的模块度（1.993）和较高的密度（0.103），关键枢纽节点包括携带hao的Cupriavidus和Nocardia，以及携带nosZ的Burkholderia和Rhodopseudomonas。土壤pH和EC是塑造DCDBA网络的主要环境因子。

**3.6 土壤性质、功能基因与N₂O排放的整合关联**
Mantel检验显示AOB amoA和hao丰度与NH₄⁺-N负相关、与NO₂^--N正相关；nosZ丰度与总N₂O排放强负相关。PLS-PM识别出两条主要路径：一是复合抑制剂负向影响amoA和hao丰度，限制NH₄⁺-N消耗，减少N₂O底物库；二是复合抑制剂直接降低土壤EC和CEC，进而负向影响反硝化基因（nirS、nosZ）丰度，进一步促进N₂O减排。

**4. 讨论与结论**

讨论部分指出，DCDBA的优异效果源于DCD对AMO的直接抑制与酚酸对细胞膜完整性和群体感应的破坏形成的双靶点机制。代谢组学证据显示酚酸诱导了广泛的细胞包膜应激（如磷壁酸生物合成富集），同时氮同化相关代谢（维生素B6、氨基酸代谢）可能促进NH₄⁺进入有机氮库，与直接抑制氨氧化互补。检测到guanylurea和ammeline以及阿特拉津降解通路富集，提示DCD在培养中发生了转化。复合处理中nirS/nosZ丰度增加并非底物竞争导致，而是抑制剂环境过滤下高拷贝数类群（如Pseudomonas、Azoarcus）被选择性富集，同时nosZ丰度提高有助于将N₂O还原为N₂。网络分析表明DCDBA并未消灭微生物群落，而是塑造了更模块化、有组织的共现结构。研究结论认为，DCD-酚酸组合在盐碱化稻田土壤中有效抑制了硝化作用，其中DCDBA效果最强，其机制涉及化学抑制氨氧化、降低AOB amoA和hao丰度所代表的硝化功能潜力，以及氮同化、细胞应激和抑制剂转化相关的微生物-代谢物变化。该研究为复合硝化抑制剂的开发提供了整合框架，未来需在田间条件下验证其性能、持久性、作物响应和环境安全性。