《Food Bioscience》：Effect of Enzymatic Hydrolysis and
In Vitro Gastrointestinal Digestion on the Phenolic Profile and Bioaccessibility of Protein Hydrolysates from
Spirulina platensis
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摘要本研究评估了酶解和体外模拟胃肠道消化对Spirulina platensis蛋白浓缩物酚类物质组成、生物可及性和抗氧化能力的影响。水解采用Alcalase、木瓜蛋白酶和Flavourzyme进行。水解产物随后经过由胃相和小肠相组成的两阶段模拟胃肠道消化模型处理。通过高效液
摘要
本研究评估了酶解和体外模拟胃肠道消化对Spirulina platensis蛋白浓缩物酚类物质组成、生物可及性和抗氧化能力的影响。水解采用Alcalase、木瓜蛋白酶和Flavourzyme进行。水解产物随后经过由胃相和小肠相组成的两阶段模拟胃肠道消化模型处理。通过高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）对单个酚类化合物进行初步鉴定和定量分析，同时通过分光光度法测定总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）和铁还原抗氧化能力（FRAP）。结果表明，消化前根据所用酶的不同，S. platensis蛋白水解物在TPC、TFC和FRAP方面存在显著差异。混合未水解对照组的TPC为11.20 ± 0.33 mg GAE/g DW，而Alcalase水解物（AH）含量最高，为22.01 ± 0.34 mg GAE/g DW；木瓜蛋白酶水解物（PH）和Flavourzyme水解物（FH）分别为12.41 ± 0.01和14.75 ± 0.30 mg GAE/g DW。此外，对照组（4.94 ± 0.18 mg CE/g DW）和AH显示出较高的TFC值（6.15 ± 0.27 mg CE/g DW）。没食子酸在胃相期间大幅增加，从31.46 ± 1.47升至481.40 ± 21.52 mg/kg DW，而(+)-儿茶素在胃相和小肠相的对照组中超过1200 mg/kg DW，表现出较高的回收率和生物可及性。总体而言，结果表明酚类物质的提取率增加并不一定改善生物可及性，强调了消化稳定性在确定Spirulina来源酚类物质功能潜力中的重要性。
引言
微藻凭借其高营养密度、快速生物量生产能力和多样的生物活性化合物组成，已成为开发功能食品和营养保健品的重要生物资源。在具有商业价值的物种中，Spirulina platensis因其极高的蛋白质含量、平衡的氨基酸谱和公认的安全食用历史而备受关注。这些特性使Spirulina成为解决当前可持续营养和健康导向食品设计中挑战的有前景的原料（Lafarga等人，2020；Plaza等人，2009）。除蛋白质部分外，Spirulina还含有多种酚类化合物，对其抗氧化潜力有重要贡献。先前的研究已在Spirulina及其他微藻物种中鉴定出酚酸、黄烷-3-醇和黄酮醇，尽管其含量通常低于陆生植物（Goiris等人，2012；Safafar等人，2015）。重要的是，微藻中的酚类化合物往往嵌入复杂的细胞基质中，并可能与蛋白质、多糖和色素发生强烈的相互作用，从而显著影响其可提取性、稳定性和消化归宿（Bermudez等人，2024；Nemli等人，2024）。
为克服基质相关的局限性，酶解法已被广泛用于富含蛋白质的底物（包括微藻），以提高其技术功能特性并释放生物活性肽。Alcalase、木瓜蛋白酶和Flavourzyme等蛋白酶不仅能改变蛋白质结构，还能破坏蛋白质-酚类物质的非共价相互作用，从而增加水解体系中的表观酚类含量（Li等人，2021；Mohammadi等人，2022；Nemli等人，2024）。然而，加工后观察到的提取率增加并不一定转化为更大的生理相关性，因为酚类化合物可能在胃肠道消化过程中发生广泛转变。
本研究选择Alcalase、木瓜蛋白酶和Flavourzyme，以代表具有不同且互补作用模式的蛋白水解系统。Alcalase是一种具有广泛底物特异性的微生物内切蛋白酶，而木瓜蛋白酶是一种来源于植物的半胱氨酸内切蛋白酶，具有不同的切割偏好。相比之下，Flavourzyme是一种具有内切肽酶和外切肽酶活性的真菌酶制剂，能够实现广泛的蛋白质切割和进一步的肽降解（Cian等人，2013；Merz等人，2015）。因此，使用具有不同催化特性的蛋白酶预期会产生不同的蛋白质破坏和蛋白质-酚类物质相互作用模式，从而能够评估酚类物质释放方面的酶依赖性差异。此外，这些商业酶制剂在食品蛋白质水解中得到了广泛应用，支持了其技术相关性。
体外模拟胃肠道消化模型被广泛用于评估酚类化合物在生理相关条件下的稳定性、转化和肠道可利用性。生物可及性是指食物成分在胃肠道消化过程中从食物基质中释放出来并可能可供肠道吸收的部分，而生物利用度还包括吸收和随后被身体利用的过程（Fernández-García等人，2009）。因此，体外消化模型可以估算潜在的生物可及性，但不能直接反映体内生物利用度（Minekus等人，2014）。大量文献表明，消化可以显著改变酚类物质的组成，导致选择性释放、降解或与大分子重新结合，最终决定生物可及性和抗氧化特性（Günal-K?ro?lu等人，2022；Hamzalioglu等人，2023；Wojtunik-Kulesza等人，2020）。虽然这些现象在植物性食物中已有充分记录，但针对微藻系统的研究相对较少，而专门关注蛋白水解物的研究更是凤毛麟角。然而，静态体外模型无法完全复制人体胃肠道的动态复杂性，包括个体间差异、胃肠转运、肠道吸收、宿主代谢、结肠发酵以及与肠道微生物群的相互作用。
现有针对Spirulina蛋白水解物的研究大多侧重于与肽相关的生物活性，如抗氧化或抗高血压作用，通常未考虑酚类化合物在消化过程中的同步行为（Lafarga等人，2020）。此外，涉及酚类化合物的研究经常依赖总酚测量，这无法深入了解单个酚类化合物在消化过程中的变化，而这些化合物在稳定性、生物可及性和对抗氧化活性的贡献方面可能差异显著（Wojtunik-Kulesza等人，2020）。
本研究的主要目的是确定酶解和模拟胃肠道消化如何影响S. platensis蛋白浓缩物的酚类组成和生物可及性。次要目标包括：（i）表征Alcalase、木瓜蛋白酶和Flavourzyme处理后单个酚类化合物的变化；（ii）评估消化过程中的回收率和生物可及性指数；（iii）考察单个酚类化合物、总酚和黄酮含量与FRAP抗氧化能力之间的关系。为实现这些目标，蛋白浓缩物分别用Alcalase、木瓜蛋白酶和Flavourzyme进行水解，然后进行模拟胃和小肠消化。单个酚类化合物通过HPLC-DAD进行表征，总酚和黄酮含量以及FRAP抗氧化能力通过分光光度法测定。这一综合方法用于对Spirulina来源酚类化合物的消化依赖性行为进行更全面的评估。
章节摘要
材料、化学品和试剂
本研究使用的Spirulina platensis粉末从中国陕西CN Lab Nutrition Asian Group商业采购。供应商未提供关于具体菌株、培养条件或收获期的信息。
无水碳酸钠、福林-酚试剂、氯化铝、亚硝酸钠、乙腈和甲醇均购自Merck（德国达姆施塔特）。用于体外模拟胃肠道消化和酶解的钠
总酚含量、总黄酮含量和抗氧化能力
S. platensis蛋白水解物在消化前根据所使用的酶（Alcalase、木瓜蛋白酶、Flavourzyme）不同，在总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）和抗氧化能力（FRAP）方面表现出显著差异（图3）。双因素方差分析显示，酶处理、消化阶段及其交互作用对所有三个参数均有显著影响（p < 0.0001；表5）。消化前，混合未水解对照组的总酚含量为
结论
本研究表明，S. platensis蛋白浓缩物的酚类组成和抗氧化能力在酶解后经过体外胃肠道消化被显著重塑。具体而言，Alcalase酶预处理显著提高了各种酚类化合物的初始提取量，表明从Spirulina基质中释放或可提取性增强。然而，胃肠道消化成为驱动这些物质
CRediT作者贡献声明
Salih Aksay：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、方法学、调查研究、资金获取、概念化。R?dvan Arslan：撰写——审阅与编辑、撰写——原稿、可视化、验证、软件、资源、方法学、调查研究、资金获取、形式分析、数据整理、概念化
未引用参考文献
Guimar?es Drummond e Silva等人，2017。
伦理批准和参与同意
不适用。本研究不涉及人类参与者或实验动物。
作者批准
所有作者均已阅读并批准修订后手稿的最终版本，并同意将其提交至Food Bioscience。
资助
本研究未获得公共、商业或非营利领域任何资助机构的特定拨款。
利益冲突声明
作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
R?dvan Arslan | Salih Aksay
塔尔苏斯大学理工职业技术学院食品工程系，33100梅尔辛，土耳其
