米曲霉β-半乳糖苷酶对橙皮苷的区域选择性半乳糖苷化显著提高水溶性和支气管保护活性

《Food Bioscience》：Regioselective galactosylation of naringin by Aspergillus oryzae β-galactosidase markedly enhances water solubility and bronchoprotective activity

　　

摘要

柚皮苷是一种具有多种生物活性的重要柑橘类黄酮，本研究利用来自稻曲霉NYO-2的β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）对其进行区域选择性半乳糖苷化，以改善其理化性质和生物特性。通过LC–MS和NMR分析鉴定新形成的柚皮苷半乳糖苷为O-β-D-半乳糖-(1→6)-柚皮苷。进一步通过响应面法（RSM；R² = 0.9871）优化生产条件，在最优条件（250 mM乳糖，20 mM柚皮苷，5 U酶）下实现摩尔转化率21.45%。合成的柚皮苷半乳糖苷的水溶性比天然柚皮苷提高了2,625倍。在空气动力学直径≤10 μm的颗粒物（PM₁₀）刺激的BEAS-2B支气管上皮细胞中评估了其支气管保护作用，柚皮苷半乳糖苷通过减少IL-6分泌、抑制NF-κB信号通路、恢复凋亡相关基因表达，以及降低MCP-1和MUC5AC蛋白表达1.59倍和2.46倍，显著减轻了炎症反应，这通过Western印迹和免疫荧光测定。分子对接进一步表明半乳糖苷化增强了柚皮苷对炎症和凋亡相关靶蛋白的结合亲和力，支持了在支气管上皮细胞中观察到的抗炎效果。总之，这些发现表明酶法区域选择性半乳糖苷化显著提高了柚皮苷的溶解度和支气管保护潜力，突显了柚皮苷半乳糖苷作为营养保健、功能食品和饮料应用的潜在功能成分。

引言

空气污染与每年约670万例死亡相关，被认为是全球性的公共卫生问题。空气动力学直径≤10 μm的颗粒物（PM₁₀）是主要的大气污染物，对呼吸健康构成严重威胁（Leikauf等，2020）。PM₁₀沉积在支气管上皮细胞中，通过NADPH氧化酶激活、线粒体功能障碍和Fenton/类Fenton反应等机制诱导氧化应激和炎症反应。这些过程激活核因子κB（NF-κB）信号通路，导致单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和白细胞介素-6（IL-6）分泌增加2–3倍（Vilas-Boas等，2024）。同时，PM₁₀诱导黏蛋白5AC（MUC5AC）表达，导致黏液过度分泌（R. Yang等，2023）。因此，迫切需要能够同时靶向炎症信号、免疫细胞募集和黏液过度生产的支气管保护剂。

柚皮苷是一种苦味黄烷酮，主要存在于葡萄柚、柑橘类水果、牛至、樱桃和番茄中，赋予其特有的苦味，同时显示出作为营养保健成分的潜力，具有抗炎、降胆固醇、抗癌和抗氧化等多种药理益处（Alam等，2014）。

近期计算研究表明，分子和理化描述符在预测生物活性化合物的溶解行为方面具有重要意义，展示了数据驱动方法在理解结构–性质关系方面的潜力（Y. Zhang & Xu，2021）。例如，黄酮苷化研究突出了结构修饰作为调节黄酮理化性质和生物特性的有效策略。酶法糖基化特别具有吸引力，因为它可以在温和条件下实现区域和立体选择性修饰，从而生成结构明确的黄酮衍生物（Ding等，2026）。因此，柚皮苷的区域选择性糖基化可能提供一种调节其理化性质和功能特性的手段，这对于其对抗氧化和炎症性呼吸损伤的保护作用具有重要意义。

柚皮苷已被证明可以减轻关键哮喘症状，包括气道炎症和高反应性，还可以缓解肺纤维化、水肿、杯状细胞增生和黏液过度分泌，有助于痰液清除（Chen等，2014；Guihua等，2016）。尽管其对呼吸系统疾病具有治疗潜力——如减少小鼠和犬脂多糖引起的杯状细胞增生和MUC5AC过度分泌（Chen等，2014）、阻断LPS处理小鼠的NF-κB通路（Y. Liu等，2011），以及通过防止细胞死亡和氧化应激增强大鼠内皮功能（Pengnet等，2019），但关于其针对PM₁₀暴露的支气管保护效果的研究仍然有限。此外，其水溶性差（38 μg/mL）、对氧化剂敏感以及生物利用度低，限制了其在食品和制药领域的实际应用（Im等，2023；Seong等，2023）。

酶法黄酮糖基化主要依赖于两种方法：Leloir糖基转移酶，具有高度区域选择性，但需要昂贵的UDP-糖供体和蛋白质工程（Wang等，2024）；以及转糖基模式下的糖苷水解酶，使用乳糖等廉价供体，但存在竞争性水解和产量较低的问题（Lu等，2015）。迄今为止，大多数研究使用葡萄糖作为供体糖，对供体的立体化学（半乳糖和葡萄糖）如何影响生物活性的关注甚少。本研究弥补了这一空白。

为了克服柚皮苷溶解度差的缺陷，先前的研究使用了酶法糖基化，包括6-α-麦芽糖柚皮苷（Lee等，1999），以及我们之前的工作中合成的O-α-D-葡萄糖-(1→6)-柚皮苷，后者显示出显著改善的溶解度和神经保护活性（Im等，2023；Seong等，2023）。这些努力仅针对基于葡萄糖的糖基化，尚不清楚C4-差向异构体糖半乳糖是否能进一步改变柚皮苷的生物功能（Lu等，2015）。据我们所知，此前没有研究通过酶法半乳糖苷化柚皮苷，或将其葡萄糖和半乳糖结合衍生物在支气管保护效果方面进行直接比较。

因此，我们利用从食品中分离的稻曲霉NYO-2的β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）生产了一种新型的O-β-D-半乳糖-(1→6)-柚皮苷，并首次评估了其在PM₁₀刺激的BEAS-2B支气管上皮细胞中的支气管保护效果。此外，采用分子对接阐明半乳糖苷化如何影响关键的炎症和凋亡相关蛋白，为其增强的生物活性提供了分子基础。

各章节摘要

化学试剂

柚皮苷、Diaion HP-20树脂、硅胶60 F₂₅₄薄层板、改良Davis最小培养基（MD）、platycodin D、PM₁₀（ERMCZ120）、二甲基亚砜（DMSO）和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）均由Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）提供。人支气管上皮BEAS-2B细胞（CRL-3588）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，美国弗吉尼亚州曼萨斯）。Dulbecco改良鹰氏培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS），

柚皮苷半乳糖苷的酶法合成

β-半乳糖苷酶广泛应用于乳制品行业以去除乳糖和合成半乳糖寡糖。尽管该酶具有广泛的实用性，但在极端温度下稳定性差仍是主要的操作缺陷（Shafi等，2021；Urrutia等，2013）。在本研究中，从117株从韩国发酵食品中分离的微生物菌株中筛选并获得了来自稻曲霉NYO-2的高活性（79 U/mg）β-半乳糖苷酶（图S2）。在真菌来源中，

结论

在本研究中，对从食品中分离的稻曲霉A. oryzae NYO-2的β-半乳糖苷酶进行了表征，并通过区域选择性酶法转半乳糖苷化合成了O-β-D-半乳糖-(1→6)-柚皮苷，一种新型的柚皮苷半乳糖苷。通过响应面法优化生产条件，在最优条件（250 mM乳糖，20 mM柚皮苷，5 U酶）下实现摩尔转化率21.45%。合成的柚皮苷半乳糖苷的水溶性提高了2,625倍

CRediT作者贡献声明

Jeongjin Park：方法学、调查、形式分析。Hayeong Kim：写作—审阅与编辑、验证、方法学、形式分析。Geon Woo Lim：方法学、形式分析。Hyeon-Jun Seong：写作—原稿、可视化、方法学、形式分析、数据管理。Seung-Hee Nam：写作—审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。Doman Kim：写作—审阅与编辑、方法学、形式分析。Kwang-Yeol Yang：

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些可能影响本研究中报告的工作。

数据可用性

数据将在合理请求下提供。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些可能影响本研究中报告的工作。

致谢

本研究得到了区域专业技术发展计划（RS-2026-25544133）和农村发展管理局的支持。

Hyeon-Jun Seong|Geon Woo Lim|Hayeong Kim|Jeongjin Park|Kwang-Yeol Yang|Doman Kim|Seung-Hee Nam

首尔大学国际农业技术研究生院，韩国江原道平昌郡，25354