基于基因组指导的乳酶乳杆菌BIONCL3菌株活性代谢物的分离及其生物活性研究

《Food Bioscience》：Genome Guided Investigation of Bioactive Metabolites Isolated from Lacticaseibacillus rhamnosus BIONCL3 strain and Their Biological Activities

　　

摘要

本研究从印度马哈拉施特拉邦本土Gir牛乳中分离出一株新型益生菌鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）BIONCL3。全面的表型和基因型分析证实了其益生功效，凸显BIONCL3作为功能性食品应用的有前景候选菌株。该菌株的全基因组测序（WGS）结果被划分为22个COG类别，确立了其遗传安全性，确认不存在抗生素抗性基因（AMR）、质粒、毒力因子和致病基因。此外，antiSMASH鉴定出关键细菌素基因簇（BGC），包括Garvieacin Q（garQ）、Carnocin CP52、enterocin-X-chain-beta，而gutSMASH分析揭示了硫胺素代谢和短链脂肪酸产生途径，以及104个CAZyme，以糖苷水解酶（GH）和糖基转移酶（GT）为主。BIONCL3菌株的化学谱分析显示其能够生物合成四种生物活性代谢物：吲哚-3-丙酸（IPA）、琥珀酸（SA）、苯甲酸（BA）和双（2-乙基己基）邻苯二甲酸酯（DEHP）。通过广泛的1D NMR（¹H和¹³C{¹H}）和2D NMR（HSQC、HMBC及NOESY）分析对这些代谢物的结构进行了阐明。分子对接研究显示这些生物活性分子与生物膜相关蛋白具有优异的结合亲和力，结合能分别为：与Als9-2（2Y7L）为?7.3 kcal/mol，与OprF（4RLC）为?7.3 kcal/mol，与FapC（9NQD）为?7.6 kcal/mol。表型筛选证明SA是对金黄色葡萄球菌（NCIM 2925）最强的抑制剂（MIC为31.6 μg/mL；IC₅₀为30.60 μg/mL），其次是IPA（MIC为82.00 μg/mL）。体外实验表明，二元、三元及四元协同组合表现出优异的抗菌效能（ΣFIC<0.5），使细菌膜完整性达到95至98%（7.6至8.2 μg/mL）。进一步研究表明，亚MIC水平对铜绿假单胞菌（NCIM2700）（95.65%）和白色念珠菌（NCIM3628）（88%）表现出显著的抗生物膜和膜扰动作用，凸显了BIONCL3作为功能性食品和生物医学干预候选菌株的潜力。

引言

人类微生物组已成为理解健康与疾病的关键前沿领域。乳酸菌（LAB）在肠道稳态和宿主免疫调节中发挥着关键作用。益生菌被定义为适量给予时能够带来可测量的健康益处的活微生物，通过复杂的代谢干预发挥保护作用（D'Amico等，2025）。除经典的竞争排斥外，LAB还能合成一系列生物活性分子，包括短链脂肪酸（SCFAs）、有机酸、活性氧前体分子、二氧化碳、过氧化氢以及核糖体合成的抗菌肽（Sadeghloo等，2025）。在这些功能分类群中，鼠李糖乳杆菌作为一种兼性厌氧革兰氏阳性菌，因其多样的代谢组而脱颖而出，其特点在于合成具有强效拮抗和免疫调节特性的结构代谢物和分泌代谢物（Reyes-Castillo等，2025）。阐明代谢物的化学指纹和生物机制对于挖掘其在治疗、营养保健和工业生物技术中的潜力至关重要。

细菌的全面遗传蓝图能够实现精确的菌株水平鉴定，并确保其在食品系统中的安全有效应用。它还促进了代谢和生理特性、碳水化合物代谢、发酵途径、维生素、氨基酸和活性代谢物等关键化合物生物合成基因簇（BGCs）的深入功能基因组分析（Wang等，2024）。由于其广泛应用，菌株在基因组水平上的安全性评估至关重要。全基因组测序（WGS）能够鉴定参与抗生素抗性（AMR）、毒力因子和可移动遗传元件的基因，从而确保菌株在纳入制剂前的安全性和适用性（Cipriani等，2025）。先进的基因组挖掘工具（如GutSMASH）进一步增强了肠道微生物组代谢的系统性分析（Pascal等，2023）。这有助于鉴定参与肠道粘附、免疫调节、抗菌活性、细菌素、宿主相互作用和病原体抑制的基因，从而有助于开发具有靶向健康应用的下一代益生菌（Tiwari等，2024）。

能够合成特殊代谢化合物的鼠李糖乳杆菌菌株作为功能性食品中益生菌和后生元的基石。其后生元成分具有优异的稳定性，延长保质期，同时赋予强效的抗菌、抗生物膜和免疫调节益处。除生物保存外，鼠李糖乳杆菌后生元增强肠道屏障完整性，中和机会性病原体，缓解胃肠道疾病，是可持续食品安全和靶向健康应用的多功能工具。将基因组测序与代谢组学分析相结合加速了未表征生物活性分子的发现，避免了重复发现，并实现靶向分离。我们已分离出四种具有多样生物和工业应用的生物活性代谢物：双（2-乙基己基）邻苯二甲酸酯（DEHP）、吲哚-3-丙酸（IPA）、琥珀酸（SA）和苯甲酸（BA）。双（2-乙基己基）邻苯二甲酸酯是一种常用的增塑剂，由多种细菌和真菌产生，尽管其生物合成途径仍不清楚，但对其内分泌干扰效应存在担忧（Chiellini等，2013）。吲哚-3-丙酸是一种由肠道微生物产生的色氨酸衍生物代谢物，是一种强效抗氧化剂，能够穿越血脑屏障（BBB），调节炎症并支持神经健康（Zhou等，2023）。它参与代谢性和炎症性疾病（包括糖尿病和结肠炎）的管理。同样，琥珀酸是一种天然二羧酸，也是细胞柠檬酸（Krebs）循环中重要的代谢中间体。它具有抗菌、调味剂和pH调节剂的功能，有助于减少氧化应激和炎症，并应用于动物饲料中以增强肠道健康（Li等，2025）。此外，另一种重要分子苯甲酸是一种芳香羧酸，被广泛用作防腐剂和抗菌剂，其衍生物在生物燃料和药物生产的代谢工程中发挥作用（Issa等，2025）。

除直接抑制病原体外，基因组引导的表征证实代谢产物（如小环肽、有机酸和吲哚衍生物途径）直接影响宿主上皮保护和氧化应激降低。将高通量基因组预测与功能生物测定相结合，为从益生菌分离物中鉴定治疗先导化合物提供了严格的化学基础。我们优化了计算机对接参数，靶向特定的细菌生物膜结构蛋白，并通过膜渗透性测定和最低生物膜抑制浓度（MBIC）测定验证了结合相互作用。益生菌衍生的生物活性分子，特别是从鼠李糖乳杆菌中提取的分子，已成为对抗这些顽固多微生物群落的强效天然替代物。本研究探讨了鼠李糖乳杆菌代谢物对铜绿假单胞菌和白色念珠菌的抗菌和抗生物膜效能。我们通过分子对接计算研究评估了这些生物活性化合物靶向关键生物膜形成蛋白的结合亲和力。实验测定了最低抑菌浓度（MIC）并研究了亚MIC动态。此外，通过分数抑制浓度（FIC）指数分析定量评估了与标准治疗药物的协同活性，并辅以严格的统计验证以凸显其治疗潜力。

在本项研究中，分离出鼠李糖乳杆菌BIONCL3菌株并对其进行全面的益生表征。进一步进行WGS分析，评估关键安全性特征，包括抗生素抗性（AMR）、质粒、毒力因子、致病性相关基因和细菌素编码基因簇。使用¹H NMR、¹³C NMR、2D NMR和高分辨质谱（HR-MS）表征了四种生物活性分子。系统评估了这些纯化的分子在抗菌、抗真菌、生物膜破坏和诱导膜破坏（通过细胞泄漏测定）方面的能力。此外，针对临床相关的食源性细菌和真菌病原体中的关键生物膜相关蛋白进行了计算机分子对接研究，以阐明其分子靶标相互作用和作用机制。

章节摘要

采样

从印度马哈拉施特拉邦巴拉马蒂健康的Gir品种乳牛中无菌采集了50份生乳样品，使用无菌Falcon管。采样在冬季与夏季之间的过渡期进行，环境条件凉爽。采集后立即将样品置于含冰袋的保温容器中，并在3小时内运回实验室进行进一步处理。

讨论

本研究旨在分离基因组中完全不含抗生素抗性（AMR）和毒力基因的LAB，以确保其在食品系统和人类健康中的安全应用。因此，菌株分离自传统牧场和未接触抗生素的本土牛群。食品安全监管机构对这些微生物进入食物链后的安全性和功能性参数执行严格的评估。不受监管的菌株选择会损害益生菌的安全性，加剧

结论

本研究展示了新分离的本土鼠李糖乳杆菌BIONCL3的益生和后生元潜力。全面的基因组表征确立了有利的安全性和生物安全概况，不存在关键的抗生素抗性（AMR）基因和主要毒力决定因子，质粒分析也支持其进一步开发的适用性。基因组挖掘进一步揭示了多样的BGCs，包括与特殊代谢物和AMPs相关的基因簇，

CRediT作者贡献声明

Vaishnavi Mahajan：软件、形式分析、数据整理。Shivam Bhosale：软件、形式分析、数据整理。Sagar Shimpi：撰写——初稿、方法论、形式分析、数据整理。Ramavath Vinodkumar：方法论、形式分析、数据整理。Pranay Yadav：验证、软件、形式分析、数据整理。Mahesh Dharne：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、调查研究、资金获取、形式分析、概念化。Ravindar

未引用参考文献

Alanjary等，2019；Carattoli等，2014；Cosentino等，2013；D'Amico等，2025；Durrant等，2020；Issa和Mohammed，2025；Larsen等，2014；Malberg等，2020；Navale和Vamkudoth，2025；O'Leary等，2024；Pascal Andreu等，2023；Shalini等，2024；Trott和Olson，2010；van Heel等，2018；Widhalm和Dudareva，2015；Yoon等，2017；Zankari等，2012；Zhu等，2025。

资金支持

本工作由印度浦那印度科学工业研究委员会–国家化学实验室资助，项目编号为MLP002629-28

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢：

我们感谢印度政府科学与工业技术部科学工业研究委员会以及印度浦那印度科学工业研究委员会–国家化学实验室提供的必要设施支持。

Bharat Pande | Vaishnavi Mahajan | Shivam Bhosale | Sagar Shimpi | Ramavath Vinodkumar | Pranay Yadav | Mahesh Dharne | Ravindar Kontham | Koteswara Rao Vamkudoth

生物化学科学部，印度科学工业研究委员会–国家化学实验室，Dr. Homi Bhabha Road，浦那-411008，印度