串联连续固定床反应器两步酶法酸解联合制备富集OPO/OPL的人乳脂肪替代品

《Food Chemistry》：Two-step enzymatic acidolysis tandem preparation of OPO/OPL-enriched human milk fat substitutes via serial continuous packed-bed reactors

　　# 摘要特定地区的人乳脂肪替代物（HMFS）对于模拟天然人乳脂肪和改善婴儿营养素吸收至关重要。本文建立了一套串联两级酶法酸解反应系统，采用连续填充床反应器（CPBR）搭载*Candida* sp.脂肪酶（CSL）和Lipozyme TL IM，以实现HMFS的可控制备。通过系统优化底物摩尔比、进料流速和脂肪酶负载量等关键参数，在目标酸解反应与不良酰基迁移之间取得平衡。得益于稳定的传质性能，CPBR系统的产物得率更高，sn-2棕榈酸保留率优于传统间歇式反应器。精准的二级流量调节实现了对HMFS的方向性合成，使其匹配中国和西方人乳脂肪的脂质组成。长期运行和工业化放大验证证实了该系统的优异稳定性和可扩展性，为定制化高质量HMFS的大规模生产提供了一种可行的工业策略。# 引言母乳被公认为婴幼儿最优质的天然食物。其脂肪成分——人乳脂肪（HMF），为婴儿生长发育提供超过50%的能量需求（Xu, Zhang, et al., 2024）。此外，HMF通过其独特的三酰甘油（TAG）结构促进钙吸收、软化粪便并调节肠道菌群。在人乳脂肪的关键TAG中，1,3-二油酰-2-棕榈酰甘油（OPO）和1-油酰-2-棕榈酰-3-亚油酰甘油（OPL）因其重要的功能作用受到广泛关注（Sun et al., 2018; Xu, Zhang, et al., 2024; Yuan et al., 2020; Zou et al., 2016）。为模拟天然HMF的组成和营养功能，人乳脂肪替代物（HMFS）已成为高端婴儿配方奶粉中不可或缺的活性成分。不断积累的研究已确认了人乳脂肪中TAG组成的显著地区差异（Liu et al., 2022a; Wei et al., 2019）。例如，中国母乳中OPL含量明显高于OPO，而在欧洲和美国则呈现相反趋势。这些差异与膳食脂肪酸模式密切相关，特别是油酸（OA）与亚油酸（LA）的摄入比例。目前，工业生产和商业应用主要集中在OPO结构化脂质上（Wang & Wang, 2025）。基于西方人乳脂肪组成开发的富含OPO的婴儿配方奶粉已取得显著商业成功。2019年全球婴儿配方奶粉市场销售额约为556亿美元，其中中国占总销售额的32.5%，凸显其主导的市场地位。面对巨大的市场需求，开发区域适应性HMFS的合理性日益凸显。然而，当前富含OPO和OPL的HMFS的酶法制备仍面临转化效率低、结构可控性差和产品质量不稳定等瓶颈。现有策略包括微生物细胞工厂构建（Zhang et al., 2026）、一锅法酶法酸解（Ghide et al., 2022; Pan et al., 2024; Wei et al., 2024; Xu, Wang, et al., 2024）、分步水解（Zhu et al., 2025）以及醇解-酯化（Li et al., 2023）。然而，这些方法存在明显局限性：部分方法需要复杂的中间产物分离和纯化步骤，增加了工艺复杂性和成本；其他方法在反应过程中不可避免地引发酰基迁移，导致sn-2棕榈酸保留率低、目标TAG纯度低和总收率不理想。值得注意的是，几乎所有已报道的实验室和工业过程都依赖使用sn-1,3区域选择性脂肪酶的间歇式搅拌罐反应器（BSTR）。这种传统模式存在多种固有缺陷。首先，反应时间长（4至24小时），导致酶利用效率低和时间-空间收率低。其次，机械搅拌产生的高剪切力导致固定化酶颗粒破碎和失活，降低了操作稳定性并导致批次间不一致。第三，液固相接触时间延长增加了酰基迁移的风险，降低了sn-2棕榈酸保留率并促进副产物形成。第四，放大条件下的传质和传热不均匀严重削弱了工艺可重复性。综合而言，这些问题限制了具有精确控制OPO/OPL比例的HMFS的大规模、稳定、高质量生产。连续流酶催化已成为一种有前景的替代方案（Bai et al., 2026）。在各种连续流反应器构型中，连续填充床酶反应器（CPBR）是研究最广泛且最具工业适用性的类型（Britton et al., 2018; Deng et al., 2025; Franklin et al., 2021; Kong et al., 2024; Xu, Wang, et al., 2022; Xu, Zhang, et al., 2022）。在CPBR中，固定化酶稳定固定在柱内，底物连续流过床层，实现稳态操作。这种构型消除了机械搅拌的需要，提高了酶稳定性，缩小了停留时间分布，便于原位去除副产物，并显著提高了时间-空间收率。CPBR已被成功应用于简单结构化脂质的合成（Abd Razak et al., 2022; da Silva et al., 2011; Hamam & Budge, 2010; Silva et al., 2012; Vikbjerg et al., 2005; Yang et al., 2026）。然而，目前的研究主要集中在单一脂肪酸原料的酯交换，对区域选择性多脂肪酸插入或多组分TAG比例的实时调节研究有限。重要的是，CPBR系统尚未用于具有可调OPO/OPL分布的区域特异性HMFS的精确制备，这代表了一个关键技术空白。为解决上述挑战，本研究提出了一种连续、比例可调的酶法两步酸解串联策略来制备富含OPO/OPL的HMFS。据我们所知，这是首次报道通过两级串联CPBR系统实现区域特异性HMFS的可控连续合成，以匹配中国和西方人乳脂肪组成。富含PPP的分级棕榈硬脂和OA首先在CPBR-1中进行酸解反应生成富含OPO的中间体，然后与LA混合后进入CPBR-2进行第二步酸解反应，产生具有定制OPO/OPL组成的HMFS。系统研究了进料流速、反应温度和底物摩尔浓度比等关键操作参数对TAG转化和结构组成的影响，以确定最佳反应条件。该策略提高了反应精确度，增强了结构化脂质产率，并抑制了酰基迁移。所建立的策略为高度定制化区域特异性HMFS的工业化制备提供了一条可行且可扩展的途径。# 章节摘录## 试剂和酶棕榈硬脂（熔点m.p. = 58 °C）由益海嘉里有限公司（中国上海）提供。油酸（OA，纯度90%）、亚油酸（LA，纯度95%）和脂肪酸甲酯标准混合物（Supelco 37）购自Sigma-Aldrich Chemical Co., Ltd.（中国上海）。商业脂肪酶包括*Candida* sp.脂肪酶（CSL，源自*Rhizomucor miehei*，固定化在多孔丙烯酸树脂上），Lipozyme RM IM（源自*Rhizomucor miehei*的脂肪酶，固定化在……## 酶法酸解的脂肪酶筛选由于来源和结构特征不同，不同来源的脂肪酶在酶法酸解反应中对脂肪酸表现出不同的选择性和催化活性。本研究的实验方法涉及甘油三酯与两种酰基供体OA和LA之间的酸解反应。作为初步步骤，在两种脂肪酸均存在的反应条件下评估了五种商业脂肪酶的催化性能……## 结论本工作建立了一个高效且可控的两级连续填充床酶催化平台，用于区域特异性HMFS的定制合成。与传统间歇式搅拌罐反应器相比，连续流系统在提高TAG转化效率、增强sn-2棕榈酸保留率和抑制酰基迁移方面表现出优异性能，这得益于其稳定的传质性能、狭窄的停留时间分布和减少的机械剪切……## CRediT作者贡献声明**陈杭飞：** 方法学、调查研究、形式分析、数据整理。**刘石北：** 验证、调查研究。**张玉斐：** 写作——审查与编辑、写作——原始草稿、监督、方法学、调查研究、形式分析、数据整理、概念化。**郑明明：** 项目管理、资金获取。## 利益冲突声明作者声明他们没有任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些关系可能影响本文所报告的工作。## 致谢本研究由中国国家重点研发计划（2021YFD2100303）、中国农业科学院农业科技创新项目（CAAS-ASTIP-2016-OCRI）和武汉曙光计划知识创新项目（2023020201010128）资助。陈杭飞|刘石北|张玉斐|郑明明