载有植酸酶的核心-壳层微粒：通过乙醇反溶剂沉淀法实现酶的稳定化

《Food Research International》：Phytase-loaded core-shell microparticles for enzyme stabilization using ethanol anti-solvent precipitation

　　

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  开发了尺寸可控的核心-壳层微粒以保护植酸酶。
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  一种交联的藻酸-κ-卡拉胶壳层包覆的植酸酶-壳聚糖微粒。
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  实现了32.7%的负载能力，粒径均匀，为3.2微米（CV = 9.4%）。
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  核心-壳层微粒在热处理和消化后仍保持了62.7%的酶活性。

引言

治疗性酶，包括植酸酶、脂肪酶和蛋白酶，具有治疗作用，如控制糖尿病、抗炎和抗肥胖（Tandon等人，2021年）。最近的一项调查显示，消费者更倾向于可以口服的药物和补充剂（Alqahtani等人，2021年）。这些治疗性酶难以口服，因为它们对热敏感，可能被消化酶破坏，并且在低pH条件下不稳定。我们选择了植酸酶作为模型酶进行开发，因为它可以通过水解植酸来预防矿物质缺乏，释放钙、磷和其他营养物质。为此，我们需要将植酸酶封装起来，使其能够通过消化道到达小肠，在那里被吸收和利用。

多糖通过静电力与酶相互作用，这种相互作用可以被pH值和离子强度调节。研究表明，多糖可以保护酶的结构完整性，从而保持其功能（Bialas等人，2021年；Weng等人，2023年）。此外，基于多糖的酶封装允许根据pH值的变化进行可控释放，并可以针对特定目标部位进行设计。这种方法有几个优点，包括对消费者友好（天然聚合物）和生物相容性。

最近关于使用多糖（包括水凝胶、纳米粒子和微球）进行酶封装的研究基于不同的机制，如静电组装（Weng等人，2023年）、共凝聚（Li等人，2022年；Liu等人，2023年）和喷雾干燥（J. Wang等人，2023年）。尽管这类方法对消化条件具有保护作用，但所产生的酶-多糖复合物往往表现出酶活性降低（Song等人，2022年）。与其他蛋白质不同，酶只有在活性位点完全开放时才具有特定功能，因此活性降低可能是由于多糖堵塞了活性位点或至少改变了该位点的几何结构。

此前（Yang等人，2024年），我们报道了一种基于多糖的核心-壳层水凝胶珠子，它可以保护酶免受消化道的影响，同时通过减少植酸酶与多糖之间的直接相互作用来维持酶活性。

尽管我们在之前的核心-壳层水凝胶珠子研究中能够保护和维持酶功能，但该方法产生的珠子体积较大（最小直径约2-3毫米），不适合大规模生产。特别是对于食品应用来说，微米级的珠子是必需的。因此，我们开发了一种新的策略，利用反溶剂沉淀技术制造基于酶-多糖的微米级颗粒，同时保持核心-壳层结构。我们假设带正电的酶-多糖复合物可以作为核心，并通过静电相互作用与阴离子聚合物结合形成核心-壳层颗粒。反溶剂沉淀技术有助于颗粒的形成并提高粒径的均匀性。

反溶剂沉淀是通过降低某种物质在溶剂系统中的溶解度来生产纳米和微米级封装颗粒的方法（Zhang等人，2022年）。这种方法可以生产出具有大表面积的纳米到微米级的颗粒，并且可以控制颗粒的大小和分布。这种大小的颗粒可能会影响封装化合物的释放行为及其物理化学稳定性。此外，它适用于热敏感化合物，因为可以在温和条件下形成颗粒，而无需高温处理。因此，这是一种有前景的酶封装策略，可以保持酶的活性。最近的研究（Caicedo Chacon等人，2023年；Liu等人，2024年）强调了其在各种应用中的有效性，包括制药和工业过程。反溶剂的选择和工艺条件是一个关键因素。乙醇是最常用的反溶剂。基于乙醇的蛋白质聚集会影响溶解度，并有助于纳米和微粒的形成。虽然乙醇常用，但需要注意乙醇浓度不应过高，否则可能会永久损坏酶结构。因此，本研究开发了一种乙醇辅助的方法来制备尺寸可控的核心-壳层微粒，以平衡颗粒形成、酶保护和在食品系统中的实际应用性。

使用乙醇辅助的反溶剂沉淀技术制备了由植酸酶-壳聚糖核心和阴离子多糖壳层组成的植酸酶负载核心-壳层微粒。我们假设通过系统地改进制备工艺，可以生产出微米级颗粒，同时保持酶的功能性。我们评估了这些核心-壳层微粒是否能够在热和酸性条件下增强植酸酶的稳定性，同时在食品基质中保持催化活性。

章节摘录

材料

氯化钾（KCl，>99%）、来自褐藻的藻酸钠盐（中等粘度）、无水氢氧化钠（NaOH，>97%）、二水合氯化钙（CaCl₂，>99.5%）、四水合钼酸铵、三氯乙酸（TCA）和L-抗坏血酸均从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买。来自Aspergillus niger的植酸酶由DSM公司（荷兰海尔伦）提供。Pierce? rapid gold BCA（比色蛋白测定）试剂盒购自Thermo Fisher

使用乙醇的反溶剂沉淀

研究了使壳聚糖、植酸酶和植酸酶-壳聚糖复合物沉淀并保持酶功能的所需乙醇浓度。由于乙醇会影响壳聚糖的凝胶化、蛋白质聚集和蛋白质变性，因此了解这些竞争机制对于核心-壳层微粒的制备非常重要。

在高乙醇浓度下，壳聚糖会因Ca²⁺之间的交联而形成凝胶

结论

我们开发了一种乙醇辅助的核心-壳层微粒，以保护植酸酶的催化活性，同时使其免受热、酸性环境和胃肠道消化的影响。我们评估了植酸酶-壳聚糖核心-壳层微粒的制备条件。所选的核心-壳层微粒具有32.7%的负载能力，封装效率为80.3%，粒径均匀，为3.2±0.3微米，多分散性为0.178±0.118。

生成式人工智能（AI）声明

作者声明，在准备本文过程中没有使用生成式AI。使用了非生成式AI，如Office 365和Google Docs中的拼写和语法检查器以及引用管理软件。所有使用非生成式AI的情况都经过了作者和编辑的审查。

CRediT作者贡献声明

Eunhye Yang：撰写——审稿与编辑，原始草稿撰写，可视化，研究，形式分析，概念化。Waritsara Khongkomolsakul：撰写——审稿与编辑，研究，概念化。Younas Dadmohammadi：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取，概念化。Alireza Abbaspourrad：撰写——审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了比尔及梅琳达·盖茨基金会（美国华盛顿州）提供的营养研发计划（INV-043930）的支持。

Eunhye Yang|Waritsara Khongkomolsakul|Younas Dadmohammadi|Alireza Abbaspourrad