《Food Research International》：Mechanism of bile salt-promoted β-lactoglobulin digestion: a structural demasking perspective
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•CD/FTIR结果显示，BS暴露后β-Lg的二级结构重排程度有限。•ANS荧光表明，BS添加后疏水性暴露程度增加。•胆汁盐增加了疏水核心附近切割位点的可及性。•LC–MS揭示了BS依赖性的β-Lg肽谱变化。•胆汁盐通过位点特异性去遮蔽作用重新引导蛋白水解途径。引言胆汁盐（B
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CD/FTIR结果显示，BS暴露后β-Lg的二级结构重排程度有限。
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ANS荧光表明，BS添加后疏水性暴露程度增加。
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胆汁盐增加了疏水核心附近切割位点的可及性。
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LC–MS揭示了BS依赖性的β-Lg肽谱变化。
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胆汁盐通过位点特异性去遮蔽作用重新引导蛋白水解途径。
引言
胆汁盐（BS）是两亲性分子，在胃肠道中作为必需的生物表面活性剂发挥作用（Wilde & Chu, 2011）。尽管其经典定义是乳化膳食甘油三酯以促进吸收（Boyer, 2013; Maldonado-Valderrama, 2019），但其理化影响远不止于脂质代谢过程。凭借其甾体骨架，BS作为去污剂与蛋白质广泛相互作用（Boyer, 2013）。除脂质消化外，BS还会结合经胃蛋白水解后产生的膳食蛋白质和多肽。这种相互作用影响蛋白质的溶解度和酶的可及性（Bellesi & Pilosof, 2021）。由于蛋白质/多肽与BS的相互作用在十二指肠条件下十分常见，因此有必要利用更贴近生理的体外模型开展分子层面的进一步研究，以阐释由此产生的效应。
此类调控的一个主要靶标是β-乳球蛋白（β-Lg），它是牛乳清蛋白中含量最丰富的球状蛋白。β-Lg的结构核心是一个由八条反平行链组成的β-桶状结构，形成一个疏水性杯状腔体（Kontopidis et al., 2004）。这种紧密折叠构象可抵御胃内消化，确保大部分蛋白以天然或近天然形式进入十二指肠阶段（Benedé et al., 2014; Maldonado-Valderrama et al., 2011）。一旦β-Lg进入肠道环境，其进一步降解不仅取决于胰腺蛋白酶的水解活性，还受BS所营造的理化环境的影响。
目前主流的蛋白消化理论认为，有效的水解需要一个"去遮蔽"步骤——即底物展开以暴露特定的肽键供酶活性位点识别（Vorob'ev, 2025）。对于如β-Lg这类抗胃消化的蛋白质而言，这一"去遮蔽"过程至关重要。先前的研究提示BS可能是"去遮蔽"的关键驱动力。Gass等人（2007）证明，生理浓度的结合态BS可显著加速β-Lg的水解。此后，Cremers等人（2014）和Dulko等人（2021）通过圆二色谱（CD）提供了结构证据，表明BS可诱导球状蛋白发生部分二级结构丢失。在蛋白质组学领域，这种"去污剂效应"常被利用以提高胰蛋白酶消化效率和肽段覆盖率（Danko et al., 2022; Serra et al., 2016）。最近，Takkella等人（2025）报道，牛磺胆酸钠在酸性条件下可诱导β-Lg发生显著的结构性变化和聚集，而在pH 6.2条件下变化相对有限。这些观察表明，BS诱导的β-Lg结构响应强烈依赖于pH值、BS种类以及蛋白质的理化状态。
在现有文献中，BS诱导的结构扰动尚未被明确关联到特定的蛋白水解结果。虽然已知BS可加速β-Lg的水解，但在结构去稳定过程中被去遮蔽的具体切割位点仍未得到充分表征。当前的消化模型往往忽视了由BS-蛋白质相互作用所导致的表面拓扑变化及酶可及性的改变。阐明这些机制对于理解疏水性营养物质的释放动力学以及免疫原性序列的存留具有重要意义。
因此，本研究通过整合光谱结构分析与高分辨率肽组学，探讨BS暴露与β-Lg结构和蛋白水解行为变化之间的关联。我们在生理BS浓度范围内绘制了BS依赖性的肽谱变化图谱，并将这些变化与反映构象扰动的谱学指标相关联。这种方法为讨论底物可及性的改变如何影响球状乳清蛋白的蛋白水解行为提供了位点分辨率的依据。
章节摘要
材料
猪胰蛋白酶（T0303）、胰凝乳蛋白酶（C7762）、猪胃蛋白酶（P7012）和牛血清白蛋白（A1933）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）和BS（牛胆汁，胆汁酸含量≥70%）购自北京索莱宝科技有限公司。荧光胺购自MedChemExpress（美国新泽西州）。β-乳球蛋白（L890177）购自麦克林（中国）。钙黄绿素（Amethyst）钠
CD和ANS分析
圆二色谱（CD）在蛋白质结构、稳定性及相互作用研究中应用广泛（Greenfield, 2007; Jones, 2022）。远紫外区（190–250 nm）可揭示不同的光谱特征（Greenfield, 2007; Kelly et al., 2005），例如α-螺旋通常在208和222 nm处呈现"双负峰"模式，而β-折叠则在216–218 nm附近具有负吸收带（Johnson, 1990）。这些特征可用于定量估算二级结构含量。
结论
总体而言，光谱、疏水性、电泳、动力学及肽组学的综合结果表明，在所测试的肠道模拟条件下，BS改变了β-Lg的结构状态和蛋白水解行为。CD和FTIR结果显示，整体二级结构框架基本得以保留，而ANS荧光则表明BS处理后疏水暴露程度增加。消化实验、SDS-PAGE及LC–MS肽段图谱进一步显示β-Lg水解加速。
CRediT作者贡献声明
张知悦：撰写——原稿，软件，资源，方法，调查，正式分析，数据整理。Timothy V. Kirk：撰写——审阅与编辑，监督，软件，方法，概念化。陈晓东：撰写——审阅与编辑，监督，资源，项目管理，资金获取，正式分析。
资金支持
本研究由Pro-health Instrumentation（苏州）有限公司资助，中国江苏省苏州市。
未引用参考文献
Macierzanka, Torcello-Gómez, Jungnickel and Maldonado-Valderrama, 2019
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
张知悦|Timothy V. Kirk|陈晓东
