依克多因增强脂肪酶在无溶剂合成阿魏酸酯化酰基甘油中的催化性能

《Food Research International》：Ectoine enhances the catalytic performance of lipase in the solvent-free synthesis of feruloylated acylglycerols

　　

• 外消旋四氢甲基嘧啶羧酸 (Ectoine) 改善了粗糙拟青霉脂肪酶在无溶剂体系中的催化性能。
• 外消旋四氢甲基嘧啶羧酸提高了酯交换反应中主产品的产率。
• 水分子可被外消旋四氢甲基嘧啶羧酸取代以稳定脂肪酶的构象。
• 外消旋四氢甲基嘧啶羧酸增强了脂肪酶的热稳定性、醇稳定性和可重复使用性。
• 外消旋四氢甲基嘧啶羧酸的作用机理与优先排除模型一致。

引言
阿魏酸 (FA) 是一种天然存在的酚酸，具有多种生物活性。作为一种天然衍生的抗氧化剂，它在食品工业和生物制药等各个领域都展现了广泛的应用潜力。然而，FA 水溶性和脂溶性较差，难以在工业生产中有效利用。最近，FA 衍生物的合成逐渐成为研究重点，以增强其在工业应用中的实用价值 (Han et al., 2023)。FA 分子含有四个反应性基团：羧基、酚羟基、双键和芳环。修饰其中一个或多个反应性基团可以得到相应的 FA 衍生物。目前，FA 的酯、酰胺和醚均已成功合成 (Huang et al., 2026)。其中，FA 酯保留了 FA 的强抗氧化性能并表现出良好的脂溶性，它们被广泛用作脂质基产品中的抗氧化剂，特别是在含脂食品中。其合成策略主要涉及化学合成或生物催化合成 (Zheng et al., 2020)。Esche 等人报道了通过化学偶联策略，利用植物甾醇和 FA 的酯化反应成功合成了甾醇阿魏酸酯 (Esche et al., 2012)。然而，传统化学体系中的生物催化合成需要大量有机溶剂，生产过程不安全且易造成环境污染，不当处理可能导致有害物质残留，进而可能引发食品安全事故。因此，无溶剂脂肪酶催化体系作为一种极具前景的清洁反应新技术，引起了学术界和食品工业界的极大关注。

与常规化学合成及其他非水催化体系相比，利用反应物本身的液态作为反应介质的无溶剂体系避免了有机溶剂的使用，从而消除了有害化学残留的风险，并显著减少了废物排放。该技术具有许多优势，包括安全性高、反应速率快、转化率高以及选择性好。同时，由于其优异的催化性能，脂肪酶能高效催化酯化、酯交换等各种转化反应。Blanco 等人报道了使用 Novozym 435 脂肪酶作为催化剂，在无溶剂体系中合成二氢阿魏酸单酯 (Blanco et al., 2025)。此外，粗糙拟青霉脂肪酶 (CRL) 也可作为生物催化剂催化阿魏酸乙酯 (EF) 和三油酸甘油酯 (TO) 之间的酯交换反应，在无溶剂体系中生成亲脂性食品抗氧化剂阿魏酰油酸甘油酯 (FOG；甘油二油酸阿魏酸酯，FDO；以及甘油单油酸阿魏酸酯，FMO)。作为食品和油脂化学工业中最广泛使用、可商用且性价比高的脂肪酶之一，CRL 在低水介质中对 TO 等体积庞大的甘油三酰基甘油酯底物表现出高催化活性，这得益于其灵活的盖域和宽泛的底物结合口袋 (Salgado et al., 2022)。更重要的是，CRL 对甘油三酰基甘油酯的 sn-1,3 位表现出独特的选择性，使其非常适合三油酸甘油酯与酚酸酯的选择性酯交换以生产结构明确的酰基甘油 (Laguerre et al., 2017)。与其他常用脂肪酶（如南极假丝酵母脂肪酶 B 或米根霉脂肪酶）相比，CRL 提供了一种性价比高的可溶性酶系统，允许在固定化载体的干扰影响下直接评估添加剂对酶构象和稳定性的影响。在我们之前的研究中，我们成功建立了脂肪酶催化的 EF 和 TO 无溶剂酯交换反应，从而合成了 FOG (Xin et al., 2009)。

尽管具有这些优势，但无溶剂体系中 CRL 催化的酯交换反应面临几个关键挑战，严重限制了其实际应用。首先，反应产生乙醇作为副产物，这对 CRL 产生竞争性抑制作用。随着反应时间的增加，乙醇的积累严重损害了脂肪酶的催化性能。其次，反应体系中的水活度 (Aw) 关键影响酶的 hydration 状态和构象灵活性。在低 Aw 且水分子含量极少的无溶剂体系中，脂肪酶分子难以保持其结构柔韧性，导致催化活性较差 (Zou et al., 2025)。相反，随着 Aw 增加，反应平衡向水解方向移动，产生 FA 作为副产物，并降低酯交换主产品的产率。因此，很难仅通过增加反应体系的 Aw 来提高产率 (Sousa et al., 2021)。此外，虽然较高温度通常增加反应体系的活化能并加速反应速率，但在酶反应中，过高的温度会导致催化性能急剧下降甚至酶失活 (Zou et al., 2024)。因此，在低 Aw 的无溶剂体系中，必须同时解决三个关键问题：维持 CRL 的柔韧性和催化活性、避免水解副反应的同时解决酶活性低的问题，以及确保提高反应温度时脂肪酶的稳定性 (Santos et al., 2023)。

为了解决这些挑战，之前的研究探索了各种策略，包括酶固定化、蛋白质工程以及添加糖类、多元醇和离子液体等保护性添加剂。其中，使用兼容溶质作为酶稳定剂引起了特别关注。外消旋四氢甲基嘧啶羧酸 (Ect) 通过增强酶分子的结构稳定性充当高效的酶保护剂，从而增加其对变性条件的耐受性，并保护其免受高温、极端渗透压、干燥和冻结等不利因素的影响 (Feng et al., 2024; Li et al., 2023)。Ect 对酶的保护机制符合“优先排除模型”和“水替代假说”理论。前者从分子相互作用的角度解释了 Ect 的稳定机制 (图 1a)。由于 Ect 与蛋白质等生物大分子之间的排斥效应，它被排除在蛋白质的直接水合层之外 (Patil et al., 2026)。这种排斥效应减缓了水分子从蛋白质表面的扩散速率，增强了蛋白质的水合，从而维持其水合层的稳定性并确保蛋白质构象的稳定性。后者指的是在低温或脱水条件下，当酶分子表面的结合水丢失时，Ect 可以取代水分子并与酶结合，维持酶的稳定高级构象 (Boroujeni & Nayeri, 2018)。

此外，与其他酶保护剂相比，Ect 在多个维度上具有显著优势。在经济可行性方面，其生产过程逐渐成熟 (图 1b)，使其整体使用成本更具竞争力；关于对反应介质的影响，它不干扰反应体系的固有属性，并能最大程度地维持反应环境的稳定性；在效率方面，即使在低浓度下也能充分保护酶分子结构，显著减少了实际应用中的所需用量。因此，Ect 已成功用于保护各种酶（如辣根过氧化物酶、乳酸脱氢酶和限制性内切酶），在包括冻融循环、热处理和暴露于有机溶剂在内的广泛应激条件下。Parwata 小组发现，添加酶保护剂 Ect 有效增强了脂肪酶在高温和甲醇条件下的稳定性 (Parwata et al., 2021)。Cyplik 等人报道了 Ect 作为一种高效的酶活性防腐剂，显著增强了硝酸盐还原酶和脂肪酶在废水处理生物处理过程中的催化效率 (Cyplik et al., 2012)。

尽管许多研究探索了 Ect 作为通用蛋白质稳定剂在水溶液或水 - 有机混合体系中的作用，但尚无研究调查 Ect 是否能在特征为极低含水量、高底物粘度和持续乙醇积累的无溶剂酶法酯交换体系中有效增强脂肪酶的催化性能 (Hao et al., 2024)。此外，在酶催化合成亲脂性抗氧化剂领域，尽管无溶剂脂肪酶催化体系被视为传统化学合成的绿色替代品，但尚无报告表明低水条件下酶活性和选择性之间的固有权衡是否可以有效改善，也无关于酶的构象变化或其作用分子机制的报告 (Zhang, Ji, et al., 2025)。解决这些问题构成了本研究的科学必要性和创新性。

基于上述考虑，我们假设在无溶剂体系中，Ect 作为 CRL 的双重作用稳定剂：它通过优先空间排除机制作为“水替代品”，维持低水活度条件下酶的柔韧性；同时，它增强分子内相互作用，从而提高热和乙醇诱导变性的动力学能垒。我们进一步推测，这种双重保护效应使 CRL 能够解决催化活性（有利于较高 Aw）和酯交换反应选择性（有利于较低 Aw）之间的冲突。这有望解决无溶剂体系中酶催化活性低的问题，同时避免发生水解副反应。为了验证这一假设，在本工作中，我们使用 CRL 作为催化剂催化 EF 和 TO 之间的酯交换反应，在无溶剂体系中合成了 FOG (图 1c)。我们系统评估了 Ect 对反应转化率、酶活性和选择性、热动力学和热力学性质以及酶构象的影响，并阐明了 Ect 增强无溶剂体系酶催化反应中 CRL 催化性能的机制。本研究为无溶剂体系中 FA 衍生物的酶法合成提供了有价值的见解，并有助于推进天然酚酸抗氧化剂在脂质基食品工业中的快速发展。

章节摘要
材料与试剂
游离型粗糙拟青霉脂肪酶 (CRL, Type VII, 目录号 L1754, ≥700 单位/毫克固体) 由 Sigma Aldrich Co. (美国密苏里州圣路易斯) 提供。阿魏酸乙酯 (CAS 4046-02-0)、三油酸甘油酯 (CAS 122–32-7) 和 外消旋四氢甲基嘧啶羧酸 (CAS 122–32-7) 购自于源生物科技 (中国上海)。薄层层析硅胶、3 A 分子筛 (CAS 308080–99-1) 和阿拉伯胶 (CAS 9000-01-5) 购自智远化学试剂 (中国天津)。二氯甲烷 (CAS...

Ect 对酯交换反应的影响
在无溶剂体系中，使用 CRL 作为催化剂催化 EF 和 TO 之间的酯交换反应以合成 FOG。使用主产品 FDO 和 FMO 的转化率作为性能指标来研究添加 Ect 对酯交换反应的影响 (图 2a)。与未添加 Ect 的情况（转化率 42.5%）相比，添加 Ect 导致转化率达到不同程度的提高 (p < 0.05)。这可能是……

结论
在本工作中，在无溶剂反应体系中，EF 和 TO 在 CRL 催化下进行酯交换反应以生产亲脂性食品抗氧化剂 FOG。通过涉及添加酶保护剂 Ect 的调控策略提高了 CRL 在反应体系中的催化性能。结果表明，添加低浓度 (2 mmol/L) 的 Ect 显著增强了 CRL 在合成 FOG 中的催化性能；在……

CRediT 作者贡献声明
Haixin Bi: 起草 – 原始草稿，软件，调查，数据整理。Jiaying Xin: 监督，项目管理，资金获取。Qi Song: 起草 – 原始草稿，方法论，数据整理。Lirui Sun: 验证，调查。Jinhui Xie: 验证，调查。Chungu Xia: 起草 – 审阅与编辑。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能被认为影响了本文报告的工作。

致谢
本工作得到了国家自然科学基金 (21573055) 和哈尔滨商业大学研究生创新计划 (YJSCX2025-831HSD) 的支持。

Haixin Bi|Jiaying Xin|Qi Song|Lirui Sun|Jinhui Xie|Chungu Xia