细胞包膜损伤的机制洞察以指导大肠杆菌的可控超声波灭活：整合多场效应与机器学习

《Food Research International》：Mechanistic insights into cell-envelope damage to inform controllable ultrasonic inactivation of Escherichia coli: Integrating multi-field effects and machine learning

　　摘要- 中等超声强度出人意料地使具有生长能力但不可培养（VBNC）亚群最大化，揭示了一种非单调的功率–损伤关系。- 温度和时间是灭活和诱导VBNC的主要驱动因素。- 丙二醛（MDA）和碱性磷酸酶（AKP）的渗漏可预测外膜和内膜的通透性。- 随机森林（RF）模型对可培养性、VBNC和膜损伤的预测决定系数均大于0.91。- 建立了基于机制的可调超声微生物控制框架。引言微生物污染引起的食源性疾病仍然是全球食品安全和公共卫生的持续性威胁。根据世界卫生组织的数据，每年约有6亿例病例和42万人死亡与食源性疾病相关（World Health Organization, 2024）。在众多重要病原微生物中，致病性大肠杆菌因其复杂的毒力机制和较强的环境耐受力而仍然备受关注。尤其是肠出血性大肠杆菌（EHEC），其感染剂量极低且毒力强，已成为食品安全控制的重点靶标（Etcheverría & Padola, 2013）。近期与新鲜农产品相关的暴发事件——例如2024年一起涉及有机胡萝卜的多州事件，导致48例确诊病例、20例住院和1例死亡（Centers for Disease Control and Prevention, 2024）——进一步凸显了在新鮮和加工食品基质中采取有效且可控的干预措施对抗致病性大肠杆菌的紧迫性。果蔬汁作为便捷输送维生素、矿物质和生物活性植物化学物质的载体而广受欢迎（Bardzik et al., 2016; Rossi et al., 2024）。然而，从采后处理、冷链分配到加工全过程，病原微生物污染的风险使微生物安全成为一个关键问题。在众多关注的病原体中，大肠杆菌O121:H19已被识别为果汁体系中的代表性危害因子（Lee et al., 2022; Neggazi et al., 2024）。热处理虽然仍是食品工业中最普遍的微生物控制手段，但不可避免地会破坏热敏性营养素和生物活性化合物，并损害风味、色泽和整体品质等感官特性（Bigi et al., 2023; Rostamabadi et al., 2023）。这一局限推动了对非热技术的日益关注，包括超高压处理、脉冲电场和超声波。其中，超声波通过声学空化作用产生局部高温高压、冲击波和微射流，能够在破坏微生物细胞结构的同时更好地保留感官和营养品质（Mustapha et al., 2024; Prempeh et al., 2025）。值得注意的是，超声已被证明可提高苹果汁中的酚类含量和抗氧化能力（Wei et al., 2025），而手-热-声联合作用对大肠杆菌ATCC 25922的灭活效果明显优于单独加热（Chantapakul et al., 2019; I?iguez-Moreno et al., 2025）。尽管前景广阔，但超声波从实验室可行性向工业化应用转化仍面临两大根本性挑战。第一，超声波的抗菌机制复杂，且受超声参数、介质性质和微生物种类强烈调制，难以得出可推广的灭活规律（Gera & Doores, 2011）。第二，尽管超声波与热和压力的协同效应已被充分认可，但其内在路径和关键控制节点仍未被充分理解，从而限制了基于机制的超声工艺开发。革兰氏阴性菌的细胞包膜由结构上不同的外膜和内膜组成，二者共同决定细胞的屏障功能和通透性（Nikaido, 2003; Silhavy et al., 2010）。细菌细胞包膜被认为是超声作用的主要靶点。既往研究已阐明多种损伤模式，包括包膜完整性和形态的破坏（He et al., 2021; Li et al., 2016）、外膜和内膜通透性增加（He et al., 2021）、能量代谢和膜运输受扰动（Li et al., 2018; Li et al., 2021），以及胞内蛋白、核酸和离子的渗漏（He et al., 2021; Liao et al., 2018）。在分子水平上，超声已被证明会改变膜脂质组成并干扰外膜脂质代谢，从而增加膜通透性（Yusof et al., 2016）。此外，转录组学研究揭示，参与肽聚糖生物合成（murD、murE、murF）以及与脂质、脂蛋白和脂多糖代谢相关的基因在超声胁迫下显著下调（He et al., 2021; Li et al., 2021）。这些一致的发现表明细胞包膜是关键脆弱点，但包膜损伤、细胞力学强度与通透性之间的调控联系仍有待明确。与此同时，超声灭活动力学研究主要依赖于经验模型。例如，Weibull模型能够较好地描述苹果汁中在50和60 °C下大肠杆菌K12的灭活，但在40 °C下失效（Ugarte-Romero et al., 2006）；在樱桃番茄中，对大肠杆菌、嗜温需氧菌和霉菌的最佳拟合模型在不同微生物间各异（Mustapha et al., 2020）；在甘蔗汁中，Weibull模型对大肠杆菌ATCC 25922展现出最高的拟合优度（Garud et al., 2017）。这些不一致性表明，经验模型本质上仅限于描述特定条件下的灭活行为，无法揭示机制基础，也未能提供可推广的预测框架（I?iguez-Moreno et al., 2025; Tarlak et al., 2025）。鉴于细胞包膜已被认定为关键脆弱点，一个能够定量地将包膜损伤特征与通透性响应及存活表型相关联的框架将提供有用的机制洞察。机器学习凭借其建模多变量、非线性及高度交互关系的能力，成为弥合这一缺口的有力工具（Hiura et al., 2021; Taiwo et al., 2024）。具有生长能力但不可培养（VBNC）的细胞具有在常规培养基上丧失可培养性、维持于不可培养的生理状态，并具备在适宜条件恢复时可复苏的潜力（Oliver, 2010）。VBNC的形成已在多种环境和加工胁迫下广泛报道于食源性病原体中（Dong et al., 2020）。例如，低温和营养限制可诱导副溶血性弧菌进入VBNC状态，而消毒剂胁迫则可诱发单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O157:H7的VBNC形成（Highmore et al., 2018; Truchado et al., 2021; Wong & Wang, 2004）。高压CO?处理可通过胞外酸化诱导大肠杆菌O157:H7进入VBNC状态，而前期热和酸胁迫可在所研究的条件下增强大肠杆菌的VBNC形成，但对金黄色葡萄球菌并无此作用（Yang et al., 2022; Yang et al., 2023）。这些观察结果凸显了VBNC诱导的胁迫和物种依赖特性，以及对工艺特异性量化评估的必要性，尤其对于超声波而言，这类关系仍基本未被探索。基于上述考虑，本研究以大肠杆菌为模型微生物，系统研究了在不同超声功率密度、温度、pH值和压力下细胞包膜损伤和通透性响应。将多维指标体系——包括外膜和内膜通透性、酶渗漏、离子稳态、膜脂质氧化、氧化胁迫和脂肪酸组成——与机器学习模型相结合，建立了工艺到响应、损伤到通透性的关系。为进一步评估实际应用价值，本研究采用市售杨梅汁进行了挑战试验，随后进行了冷藏储存复苏评估。综合而言，本研究旨在识别关键响应变量，并为可调超声处理提供基于机制的参数筛选框架。章节摘要菌株和培养条件大肠杆菌ATCC 25922购自明洲生物科技有限公司（中国宁波）。将该菌株接种至Luria–Bertani肉汤（LB；青岛希望生物科技有限公司，中国青岛）中，在37 °C下180 rpm振荡培养18 h。在4 °C下以7155 ×g离心10 min收集细胞，洗涤两次，并悬浮于无菌0.85%盐水中，最终浓度约为8 log CFU/mL。可培养细胞计数通过LB琼脂平板进行测定。灭活效果及基于PMA-qPCR的VBNC估算多场超声处理对大肠杆菌活细胞、可培养细胞和VBNC种群的影响见图2。在所有条件下，可培养计数随处理时间延长而逐渐降低，而VBNC计数总体呈上升趋势，表明超声不仅降低了可培养性，还诱导一部分细胞进入VBNC状态——一种休眠生存策略，在这种状态下细菌丧失了在常规培养基上形成菌落的能力，但结论本研究建立了一个基于机制的框架，将多场超声诱导的细胞包膜损伤与大肠杆菌在酸性果汁相关模拟体系中的可培养性丧失和VBNC形成联系起来。通过系统绘制功率密度、温度、pH和压力在所研究范围内的效应，我们界定了层级控制结构，其中温度和处理时间决定总体致死性，而pH和压力则对CRediT作者贡献声明丁秋迪：撰写–初稿、可视化、软件、方法、调查、形式化分析、数据整理、概念化。陆鹏：方法、形式化分析。徐卫东：方法、形式化分析。张叶钦：方法、形式化分析。王文军：方法、形式化分析、概念化。余松丰：撰写–审阅与编辑、概念化。刘冬红：指导、资金获取、概念化。胡紫怡：撰写–审阅与编辑。利益冲突声明作者声明不存在可能影响本论文所报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。致谢本研究获得国家自然科学基金（U24A20475）、浙江省自然科学基金（项目编号LQ24C200011）资助；浙江省"尖兵""领雁"研发计划（2024C01248(SD2)）；嘉善县科技计划（2024A09）资助。浙江省自然科学基金（项目编号LQN25C050002）。丁秋迪｜陆鹏｜徐卫东｜张叶钦｜王文军｜余松丰｜刘冬红｜胡紫怡