酮酯通过STAT1的β-羟基丁酰化减轻脓毒症相关肝损伤

《Immunobiology》：Ketone ester alleviates sepsis-associated liver injury through β-hydroxybutyrylation of STAT1

　　

脓毒症相关肝损伤以过度炎症和巨噬细胞激活为特征。β-羟基丁酸（β-OHB）具有抗炎作用并可诱导赖氨酸β-羟基丁酰化（Kbhb），但位点特异性Kbhb在脓毒性肝损伤中的作用仍不清楚。本研究探讨了STAT1 K679 Kbhb在酮酯（KE）对脂多糖（LPS）诱导的肝损伤保护作用中的角色。研究人员生成了STAT1p.K679R敲入小鼠，并通过LPS诱导肝损伤。KE预处理可减轻野生型小鼠的肝脏组织病理学损伤，降低血清丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶水平，并降低Bax/Bcl-2比值。这些效应在STAT1p.K679R小鼠中显著减弱。KE增加了肝脏STAT1 Kbhb，而K679R突变显著减少了这一修饰。在RAW264.7巨噬细胞中，K679R降低了β-OHB诱导的STAT1 Kbhb，而在AML12肝细胞中未观察到显著影响。KE还降低了LPS处理的野生型小鼠肝脏中M1巨噬细胞标志物、IL-6和IL-12的表达以及STAT1 Ser727磷酸化，而这些效应被K679R减弱。这些结果表明，STAT1 K679 Kbhb有助于KE抑制巨噬细胞M1极化，并参与其对LPS诱导的肝损伤的保护作用。

论文解读：酮酯通过STAT1 K679 β-羟基丁酰化减轻脓毒症相关肝损伤的机制研究

一、研究背景与科学问题

脓毒症是一种由感染引起宿主反应失调导致的危及生命的综合征，常引发多器官功能障碍。肝脏在代谢和免疫稳态中发挥核心作用，尤其易受脓毒症诱导的损伤。肝功能障碍可能进一步加剧全身性炎症失调，并与疾病进展和不良预后相关。近期实验研究强调，过度炎症、氧化应激、凋亡和应激反应信号是急性肝损伤和脓毒症相关器官功能障碍的共同病理组成部分。巨噬细胞介导的炎症在脓毒性肝损伤中起关键作用，肝脏巨噬细胞过度向促炎性M1表型极化会促进炎症介质产生并加重肝细胞损伤。信号转导子和转录激活子1（STAT1）是M1巨噬细胞极化和炎症反应的关键转录调节因子。因此，调控STAT1依赖性巨噬细胞激活可能为限制脓毒症相关肝损伤提供有效策略。β-羟基丁酸（β-OHB）是主要的循环酮体，不仅作为替代能量底物，还具有抗炎和器官保护作用的信号代谢物。β-OHB还可诱导赖氨酸β-羟基丁酰化（Kbhb），这是一种代谢响应的翻译后修饰，可调节蛋白质功能。酮酯（KE；BD-AcAc₂）是一种外源性酮体化合物，能有效提高循环β-OHB水平，并在人体中显示出可接受的耐受性。研究人员前期研究已证明，β-OHB通过诱导STAT1 Kbhb抑制M1巨噬细胞极化，并确定K679是关键修饰位点。然而，STAT1 K679 Kbhb在脓毒症相关肝损伤中的体内作用尚不明确。因此，研究人员生成STAT1^p.K679R敲入小鼠，探究STAT1 K679 Kbhb是否通过调节巨噬细胞极化介导KE对脓毒症相关肝损伤的保护作用。该论文发表在《Immunobiology》。

二、主要关键技术方法

1. 1.
   基因编辑技术：利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术生成STAT1^p.K679R敲入小鼠（由苏州赛业生物科技有限公司构建），通过将Cas9蛋白、单导向RNA（sgRNA）和携带STAT1 p.K679R替换（AAA到AGA）的供体寡核苷酸共注射到受精的C57BL/6J小鼠卵中，经繁殖获得纯合子小鼠用于后续实验。
2. 2.
   动物模型建立：采用腹腔注射脂多糖（LPS，5 mg/kg）诱导急性全身性炎症和肝损伤模型，KE组小鼠连续三天每天口服灌胃KE（3 mg/g体重/天）。
3. 3.
   组织病理学和生化分析：通过苏木精-伊红（HE）染色评估肝脏组织病理学变化，检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。
4. 4.
   分子生物学技术：采用Western blot检测蛋白表达水平，包括STAT1、磷酸化STAT1（Ser727）、Kbhb、iNOS、Bax、Bcl-2、IL-6和IL-12；通过免疫共沉淀（Co-IP）分析STAT1特异性Kbhb修饰水平。
5. 5.
   细胞实验：在RAW264.7巨噬细胞和AML12肝细胞中转染Flag标记的野生型STAT1（Flag-STAT1-WT）或K679R突变体质粒（Flag-STAT1-K679R），随后进行β-OHB处理，通过免疫沉淀结合Western blot检测STAT1 Kbhb。
6. 6.
   免疫荧光染色：使用F4/80和CD86抗体对肝脏切片进行双重免疫荧光染色，鉴定M1巨噬细胞（F4/80⁺CD86⁺）。

三、研究结果

3.1 STAT1^p.K679R敲入小鼠的生成与鉴定

通过CRISPR/Cas9技术成功生成STAT1^p.K679R敲入小鼠，基因分型和Sanger测序证实了STAT1基因中赖氨酸679被精氨酸取代（K679R）。通过繁殖获得纯合子STAT1^p.K679R小鼠，确认了敲入模型的成功建立。

3.2 STAT1^p.K679R突变减弱KE对LPS诱导肝损伤的保护作用

LPS给药导致野生型（WT）和STAT1^p.K679R小鼠均出现明显肝损伤，表现为肝组织结构紊乱、肝细胞坏死和炎症细胞浸润，血清ALT和AST水平显著升高。KE预处理显著改善了WT小鼠的这些组织病理学改变并降低了血清ALT和AST活性。相比之下，KE的这些保护作用在STAT1^p.K679R小鼠中显著减弱。此外，LPS注射显著增加了两种基因型小鼠的肝脏Bax/Bcl-2比值，KE预处理显著降低了WT小鼠的Bax/Bcl-2比值，而此效应在STAT1^p.K679R小鼠中明显减弱。

3.3 STAT1 K679R突变减少KE诱导的肝脏STAT1 Kbhb

KE处理显著提高了WT和STAT1^p.K679R小鼠的循环β-OHB水平，两组间无显著差异。Western blot显示KE处理后两种基因型小鼠的全局肝脏Kbhb水平均显著增加，表明K679R突变不影响整体肝脏Kbhb。通过Co-IP分析，KE显著增加了LPS处理WT小鼠的STAT1 Kbhb，而此增加在STAT1^p.K679R小鼠中显著减弱。总STAT1蛋白水平在各组间相当。

3.4 STAT1 K679对巨噬细胞而非肝细胞中β-OHB诱导的STAT1 Kbhb有贡献

在RAW264.7巨噬细胞中，β-OHB显著增加STAT1 Kbhb，而K679R突变显著降低了β-OHB诱导的STAT1 Kbhb。相反，在AML12肝细胞中，尽管β-OHB也诱导了STAT1 Kbhb，但β-OHB处理后WT STAT1和STAT1 K679R之间未观察到显著差异。

3.5 STAT1 K679R突变减弱KE对肝脏巨噬细胞M1极化的抑制作用

免疫荧光染色显示，LPS处理的WT小鼠肝脏中F4/80和CD86共定位增强，KE预处理减少了F4/80⁺CD86⁺信号，此效应在STAT1^p.K679R小鼠中减弱。LPS显著增加了肝脏M1巨噬细胞标志物iNOS的表达，KE在WT小鼠中显著降低了iNOS表达，而此抑制作用在STAT1^p.K679R小鼠中显著减弱。同样，KE显著抑制了LPS诱导的IL-6和IL-12表达增加，而这些效应被STAT1 K679R突变减弱。

3.6 STAT1 K679R突变与KE对STAT1 Ser727磷酸化抑制作用的减弱相关

LPS显著增加了WT小鼠的p-STAT1/总STAT1比值，KE预处理显著降低了STAT1磷酸化。然而，KE的这一抑制作用在STAT1^p.K679R小鼠中显著减弱，表现为STAT1^p.K679R+LPS+KE组小鼠的p-STAT1/总STAT1比值显著高于WT+LPS+KE组小鼠。

四、讨论与结论总结

讨论部分：本研究提供了体内证据，表明STAT1 K679在KE对LPS诱导脓毒症的保肝作用中发挥功能性作用。STAT1 K679R突变显著减弱了KE对肝损伤和凋亡的保护作用，同时伴随着对巨噬细胞M1极化、炎症细胞因子表达和STAT1 Ser727磷酸化抑制作用的减弱。K679R替换后STAT1 Kbhb的显著减少支持K679是体内重要的功能性Kbhb位点。STAT1可在多个赖氨酸残基发生Kbhb并具有不同的功能后果。研究人员前期研究发现K679在β-OHB介导的LPS诱导STAT1活化和M1巨噬细胞极化抑制中发挥重要作用，而最近Zuo等人发现K592是衰老过程中另一个功能性STAT1 Kbhb位点。K679R在RAW264.7巨噬细胞中显著降低β-OHB诱导的STAT1 Kbhb，但在AML12肝细胞中影响甚微，表明K679对STAT1 Kbhb的贡献在不同细胞类型中存在差异。此机制不同于β-OHB诱导的SOD2 K68 Kbhb通过增加SOD2稳定性和抗氧化活性来减少线粒体ROS和肝细胞凋亡的作用，STAT1 K679 Kbhb主要与炎症信号、STAT1活化状态和M1巨噬细胞极化相关。研究结果提示STAT1 Kbhb与STAT1磷酸化之间存在相互作用，但K679 Kbhb是否直接改变STAT1构象或Ser727对激酶或磷酸酶的可及性，或影响与调节蛋白的相互作用，仍需进一步生化研究阐明。局限性包括：系统性STAT1^p.K679R敲入模型无法将体内效应完全归因于巨噬细胞，髓系特异性STAT1 K679R模型可提供更强的巨噬细胞特异性因果证据；LPS模型主要反映急性内毒素诱导的炎症，不能完全再现多微生物临床脓毒症，需要在盲肠结扎穿刺或其他临床相关脓毒症模型中进一步验证。

研究结论翻译：综上所述，研究人员的发现表明，KE可提高β-OHB水平并增加STAT1 K679 Kbhb，这些变化与巨噬细胞M1极化、炎症反应和脓毒症相关肝损伤的减轻相关。这些效应在STAT1^p.K679R小鼠中的减弱支持K679残基对KE保护作用的功能性贡献，尽管K679 Kbhb与STAT1 Ser727磷酸化之间的分子关系仍有待确立。这些发现为与外源性酮症保护作用相关的免疫代谢机制提供了新的见解。