纳米银控制烟草镰刀菌根腐病的双重机制：直接抗真菌活性与诱导系统性抗性

《Industrial Crops and Products》：Dual mechanism of silver nanoparticles in controlling tobacco Fusarium root rot: Direct antifungal activity and induced systemic resistance

　　

纳米颗粒因其独特的理化性质在农业病害防治中展现出巨大潜力。本研究以四种引起烟草根腐病的优势镰刀菌（Fusarium oxysporum、F. solani、F. equiseti 和 F. proliferatum）为靶标病原体，系统评估了纳米银（AgNPs）单独及其与杀菌剂联用的抑制效果。体外实验表明，AgNPs对四种镰刀菌均表现出广谱抗真菌活性，其半数有效浓度（EC50）范围为2.89至6.83 μg/mL。值得注意的是，AgNPs（≤ 40 μg/mL）对烟草种子萌发、幼苗生长及根系发育无显著植物毒性。盆栽试验证实，AgNPs与精甲霜灵·咯菌腈（Metalaxyl-M·Fludioxonil）以4:1比例复配后，在常规用药量基础上减少25%杀菌剂用量仍能保持同等防效。机制研究表明，AgNPs通过破坏镰刀菌细胞膜完整性、增加丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）含量、降低三磷酸腺苷（ATP）水平来发挥直接抑制作用。转录组学分析进一步揭示，AgNPs处理显著下调了与ABC转运蛋白、甾醇生物合成及色氨酸代谢相关的基因表达。此外，AgNPs还能诱导烟草防御酶活性和病程相关蛋白（PR）基因上调表达，从而激活系统性抗性。本研究首次阐明了AgNPs通过直接抗真菌与诱导宿主抗性的双重机制防控烟草镰刀菌根腐病的潜力，为开发绿色高效的纳米农药提供了理论依据。

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一、研究背景与科学问题

烟草根腐病是由镰刀菌属（Fusarium spp.）引起的毁灭性土传病害，近年来在中国各主要烟区普遍发生且呈加重趋势，已成为危害烟草根茎部最严重的病害之一，造成重大经济损失。河南省作为中国重要产烟区，其烟草镰刀菌根腐病的优势病原菌包括尖孢镰刀菌（F. oxysporum）、茄病镰刀菌（F. solani）、木贼镰刀菌（F. equiseti）和层出镰刀菌（F. proliferatum）。当前生产上缺乏有效的抗病品种，病害防治主要依赖化学杀菌剂。然而，过量施用化学农药易导致农药残留、增强病原菌抗药性，并对生态安全和生物健康构成潜在威胁。因此，探索新型防治策略或开发有效手段以减少对化学农药的依赖，已成为当前烟草生产中亟待解决的关键问题。

纳米技术在农业可持续发展中展现出广阔前景。金属及金属氧化物纳米颗粒因独特理化性质在促进作物生长、提高产量和病害管理方面潜力巨大。其中，纳米银（AgNPs）具有广谱抗菌活性，对多种植物病原真菌表现强烈抑制作用，主要通过破坏细胞膜完整性、干扰细胞壁合成、阻碍DNA/RNA/蛋白质合成以及诱导活性氧过量积累等途径发挥作用。然而，AgNPs的生物安全性存在争议，低剂量可能有益于植物，但相同剂量也可能产生细胞毒性，这些差异可能与理化性质、剂量和生物系统等多种因素有关。此外，现有纳米材料与杀菌剂的组合研究多集中于二元体系（单一活性成分杀菌剂与纳米材料），而针对三元体系——即纳米材料与商业预混二元杀菌剂（如精甲霜灵·咯菌腈）的协同效应研究尚属空白。精甲霜灵·咯菌腈（Metalaxyl-M·Fludioxonil）是一种广泛用于土传病害防治的商业预混二元杀菌剂，其作用机制互补，但与AgNPs联用防控烟草镰刀菌根腐病的协同性能尚未被表征。

基于上述背景，本研究以四种优势镰刀菌为靶标，系统探究了AgNPs单独及与杀菌剂联用的毒力效应、生物安全性、田间防效及作用机制，旨在为开发绿色高效防控烟草根腐病的策略提供科学依据。

二、关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：（1）菌丝生长速率法测定AgNPs和杀菌剂对四种镰刀菌的体外抑制活性及EC₅₀；（2）Wadley法计算复配剂的协同比率（SR），评价AgNPs与杀菌剂联用的互作效应；（3）种子发芽试验、MS培养基幼苗生长试验和盆栽植株生长试验评估AgNPs对烟草生长发育的安全性；（4）小米培养基繁殖病原菌后进行盆栽接种试验，评价AgNPs与杀菌剂复配对烟草根腐病的防治效果；（5）光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察菌丝形态变化；（6）电导率法测定细胞膜相对通透性，紫外分光光度法检测核酸和蛋白质泄漏量；（7）生化试剂盒测定丙二醛（MDA）、过氧化氢（H₂O₂）、三磷酸腺苷（ATP）和可溶性糖含量；（8）转录组测序（RNA-Seq）结合定量实时荧光PCR（qRT-PCR）技术解析AgNPs对尖孢镰刀菌的分子调控机制；（9）比色法测定烟草防御酶活性，qRT-PCR检测病程相关蛋白（PR）基因表达水平。

三、研究结果

3.1 AgNPs和杀菌剂对镰刀菌的抑制活性

体外毒力测定结果显示，AgNPs对四种镰刀菌均表现出良好的抑制活性，EC₅₀值介于2.89~6.83 μg/mL之间，其中对尖孢镰刀菌的抑制效果最强（EC₅₀ = 2.89 μg/mL）。在所测试的四种杀菌剂中，精甲霜灵·咯菌腈对各镰刀菌的抑制活性最优，EC₅₀值为1.99~4.88 μg/mL。这一结果表明AgNPs具有广谱抗镰刀菌活性，且精甲霜灵·咯菌腈可作为后续复配研究的候选药剂。

3.2 AgNPs与杀菌剂复配的协同效应

将AgNPs（40 μg/mL）与精甲霜灵·咯菌腈按不同体积比复配后，通过Wadley法计算协同比率（SR）。结果表明，AgNPs与精甲霜灵·咯菌腈在4:1体积比下对四种镰刀菌均表现为协同增效作用（SR > 1.5），其中对尖孢镰刀菌的协同效应最为显著（SR = 2.08）。这一发现揭示了AgNPs与精甲霜灵·咯菌腈复配可通过互补作用靶点实现协同增效，为减少化学杀菌剂用量提供了可行方案。

3.3 AgNPs对烟草种子萌发和幼苗生长的影响

种子发芽试验显示，10~60 μg/mL AgNPs处理对烟草种子最终发芽率无显著影响，但高浓度（60 μg/mL）处理会延迟种子萌发进程。MS培养基幼苗生长试验表明，AgNPs浓度≤40 μg/mL时，烟草幼苗的根长、茎长、根数和叶片数等指标与对照无显著差异。盆栽试验进一步证实，AgNPs（≤40 μg/mL）处理后30天，烟草植株的农艺性状和根系发育参数（总根长、根表面积、根体积等）均未受到明显抑制。综合表明，AgNPs在≤40 μg/mL浓度范围内对烟草生长和发育无植物毒性，具有良好的生物安全性。

3.4 AgNPs与杀菌剂复配对烟草根腐病的盆栽防效

盆栽接种试验设置七个处理组，以4:1比例复配AgNPs与精甲霜灵·咯菌腈。结果显示，处理C（16 mL 40 μg/mL精甲霜灵·咯菌腈 + 4 mL 40 μg/mL AgNPs）的防效与常规剂量杀菌剂处理B（20 mL 40 μg/mL精甲霜灵·咯菌腈）相当。更重要的是，处理E（16 mL 20 μg/mL精甲霜灵·咯菌腈 + 4 mL 40 μg/mL AgNPs）在减少25%杀菌剂用量的条件下，仍能维持与常规剂量相当的防效。这一结果表明AgNPs与精甲霜灵·咯菌腈复配可在不牺牲防效的前提下显著降低化学杀菌剂的使用量。

3.5 AgNPs对镰刀菌菌丝形态和细胞膜完整性的影响

显微镜观察发现，AgNPs处理后的镰刀菌菌丝出现扭曲、膨大、表面粗糙等畸形形态，部分菌丝断裂。细胞膜通透性测定显示，AgNPs处理显著增加了菌丝细胞的相对电导率，且随时间延长递增。同时，胞外核酸（OD₂₆₀）和蛋白质（OD₂₈₀）泄漏量也显著升高，表明AgNPs严重破坏了镰刀菌细胞膜的完整性，导致细胞内物质大量外泄。

3.6 AgNPs对镰刀菌MDA、H?O?、ATP和可溶性糖含量的影响

生化指标测定结果表明，AgNPs处理显著提高了镰刀菌菌丝中MDA和H₂O₂含量，指示脂质过氧化加剧和氧化胁迫增强。同时，ATP含量显著下降，表明能量代谢受到抑制。可溶性糖含量无明显变化。这些结果共同说明AgNPs通过诱导氧化应激和干扰能量代谢来发挥抗真菌作用。

3.7 转录组学分析

对尖孢镰刀菌进行转录组测序，共鉴定出大量差异表达基因（DEGs）。GO富集分析显示，DEGs主要富集在膜组分、氧化还原过程和跨膜运输等生物学通路。KEGG富集分析进一步揭示，AgNPs处理显著影响了ABC转运蛋白、甾醇生物合成和色氨酸代谢等通路。具体而言，多个编码ABC转运蛋白的基因显著下调，这可能阻碍真菌对外源毒素的外排功能；甾醇生物合成相关基因的下调则可能干扰细胞膜的结构稳定性；色氨酸代谢通路相关基因的表达改变可能影响真菌的生长和致病性。qRT-PCR验证结果与转录组数据一致，确认了上述关键基因的表达变化。

3.8 AgNPs诱导烟草系统性抗性

防御酶活性测定结果显示，AgNPs处理显著提高了烟草叶片中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。qRT-PCR分析表明，AgNPs处理上调了病程相关蛋白基因（如PR1a、PR2和PR5）的表达水平。这些结果表明AgNPs不仅能直接抑制病原菌，还能通过激活防御酶系统和诱导PR基因表达来增强烟草自身的抗病能力，即诱导系统性抗性（ISR）。

四、总结与结论

本研究系统阐明了AgNPs防控烟草镰刀菌根腐病的双重作用机制。一方面，AgNPs通过破坏细胞膜完整性、诱导氧化应激（MDA和H₂O₂积累）、抑制能量代谢（ATP下降）以及调控ABC转运蛋白、甾醇生物合成和色氨酸代谢相关基因表达，直接发挥抗真菌活性。另一方面，AgNPs能够激活烟草防御酶活性（SOD、POD、CAT）并上调PR基因表达，诱导植物系统性抗性。此外，AgNPs在≤40 μg/mL浓度下对烟草安全无植物毒性，且与精甲霜灵·咯菌腈复配可产生协同增效作用，在减少25%杀菌剂用量的情况下仍保持良好防效。

研究结论：AgNPs通过直接抗真菌与诱导宿主抗性的双重机制，在防控烟草镰刀菌根腐病方面展现出巨大应用潜力。AgNPs与精甲霜灵·咯菌腈的协同复配体系为实现化学农药减量化提供了有效策略。该研究为开发基于纳米材料的绿色高效植物病害防控技术奠定了理论基础，对推动纳米农药在农业生产中的实际应用具有重要意义。论文发表于《Industrial Crops and Products》。