《aBIOTECH》：Photoperiod-entrained circadian regulation of downstream transporter networks mediates nyctinastic leaf movement in peanut
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摘要：叶片在夜间的闭合或向下折叠过程被称为睡眠运动或感夜性运动（nyctinasty），这一现象在豆科植物中广泛存在，有助于优化光合作用、节约水分并降低病原菌侵染风险。尽管该物理过程已被充分表征，但感夜性运动的分子调控机制仍知之甚少。本研究结合时间序列转录组分
摘要：叶片在夜间的闭合或向下折叠过程被称为睡眠运动或感夜性运动（nyctinasty），这一现象在豆科植物中广泛存在，有助于优化光合作用、节约水分并降低病原菌侵染风险。尽管该物理过程已被充分表征，但感夜性运动的分子调控机制仍知之甚少。本研究结合时间序列转录组分析（temporal transcriptome profiling）、光周期（photoperiod）处理及组织特异性基因表达分析，解析了花生（Arachis hypogaea）感夜性叶片运动过程中的调控网络。在正常光/暗循环条件下，叶片表现出明显的感夜性行为，而在持续光照条件下该行为受到抑制，凸显了光周期对该过程的重要性。转录组分析鉴定出具有节律性表达模式的光信号及生物钟（circadian clock）相关保守基因。关键候选基因包括具有光响应性的SWEET和aquaporin（水通道蛋白）基因，这些基因表现出明显的组织特异性表达模式，同时鉴定出一个在叶枕（pulvinus）中富集的MYB转录因子基因。启动子结合实验和报告基因实验支持了生物钟/光信号组分与这些候选下游基因之间的转录调控关联。综合以上结果，研究提出一个工作模型：光受体与生物钟协同调控转运蛋白及调控基因的表达，这可能参与花生感夜性叶片运动的调控。这些发现为豆科植物感夜性运动的后续功能研究提供了分子框架。
光周期-生物钟调控网络介导花生感夜性叶片运动的分子机制研究解读
一、研究背景与科学问题
植物体内存在由生物钟（circadian clock）驱动的内源性节律现象，其核心振荡器主要由转录-翻译反馈环路构成，包括LHY/CCA1（Late Elongated Hypocotyl/Circadian clock associated 1）、PRR（Pseudo-response regulator）家族、TOC1（Timing of CAB expression 1）以及LUX-ELF3-ELF4复合体等核心组分。光信号通过光敏色素（phytochrome）和隐花色素（cryptochrome）等光受体整合进入生物钟网络，协调光合作用、气孔运动及胁迫响应基因表达等生理过程。
豆科植物的叶片运动是生物钟调控生理学的典型范例。花生（Arachis hypogaea）与许多豆科植物一样，表现出夜间叶片闭合或向下折叠的现象，即感夜性运动（nyctinasty）或"睡眠运动"。白天叶片展开以增强光合效率，夜间闭合以节约水分并降低食草动物侵害风险。叶片运动主要由位于小叶基部的特化细胞——叶枕（pulvinus）内的膨压变化驱动，这些细胞因离子流和水含量变化而发生体积改变，从而引起叶片运动。
感夜性运动在植物中广泛存在且趋同进化，具有多重进化优势：通过夜间垂直折叠叶片减少辐射热损失，防止叶片表面过度冷却或霜冻伤害；减少富含气孔的叶片表面暴露，限制夜间蒸腾以节约水分；折叠叶片有助于疏导露水或雨水，保持小叶干燥，降低真菌病原菌侵染风险。研究表明，夜间叶角较大的花生叶片湿润性更低，对真菌锈病的敏感性也较低。
尽管叶片运动的物理过程已被充分表征，其分子调控机制仍不清楚。在含羞草科植物雨树（Samanea saman）中已鉴定出三个关键离子通道，包括慢型阴离子通道SsSLAH1和SsSLAH3以及钾通道SPORK2，其中SsSLAH1的细胞特异性生物钟表达对感夜性叶片展开起关键作用。在烟草中，水通道蛋白（aquaporin）在叶柄中表现出与叶片伸展模式一致的昼夜表达振荡，NtAQP1功能受损的转基因烟草表现出叶片昼夜运动减弱。然而，在花生这一重要豆科作物中，叶片运动的遗传和分子基础仍缺乏系统研究。因此，本研究旨在通过转录组分析揭示花生叶片运动对光周期的响应机制，鉴定关键基因和调控网络，为理解植物环境适应和生理过程优化提供理论基础。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员利用两个花生品种——匍匐型ZZ173和直立型WF190作为研究材料，在正常光周期（16小时光照/8小时黑暗）和持续光照（24小时光照）条件下处理7天后，于14个时间点采集叶片样本进行转录组测序分析。主要关键技术方法包括：时间序列转录组分析（RNA-Seq）与共表达网络分析；系统发育分析鉴定光信号及生物钟相关基因家族；RT-qPCR验证转录组数据可靠性；酵母单杂交（Yeast one-hybrid, Y1H）实验检测转录因子与启动子的直接结合；双荧光素酶报告基因实验（dual-luciferase reporter assay）验证转录调控关系；凝胶迁移实验（Electrophoretic mobility shift assay, EMSA）验证CCA1蛋白与EE基序的体外直接结合；LI-6800P便携式光合仪测定光合参数。
三、研究结果
3.1 花生叶片运动对不同光照条件表现出明显不同的响应
在8小时黑暗/16小时光照循环下，叶片在21:00关灯前完全展开，22:00部分闭合，23:00完全闭合。开灯后叶片在6:00半开，7:00完全展开，表现出明显的节律性运动，说明光周期对叶片感夜性运动具有强调控作用。相比之下，持续光照条件下叶片在24小时内始终保持完全展开状态，仅表现出轻微上下浮动，缺乏正常光/暗循环下特有的开闭行为，表明光是调控花生叶片运动的主导因素，缺乏黑暗条件阻止了叶片闭合。光合参数分析显示，正常光周期下净光合速率呈现明显的昼夜节律，在12:00左右达到峰值后下降；持续光照下峰值降低，节律调控被扰乱。气孔导度和蒸腾速率表现出相似的时间模式，而胞间CO2浓度在正常条件下于光合高峰期下降，持续光照下保持相对稳定。
3.2 花生光信号相关基因表达的变化
系统发育分析鉴定出关键光响应基因，包括PHY、CRY、PHOT1、COP1、SPA、UVR8、HY5和PIFs等。表达谱分析显示许多光信号相关基因表现出光响应节律模式，部分基因在光照阶段达到表达峰值，在黑暗中表达下调。
3.3 花生生物钟相关基因表达的变化
系统发育分析鉴定出花生中保守的生物钟调控因子。大多数生物钟相关基因在光暗转换前后达到表达峰值，例外包括chr06.3134_ELF3和chr01.3196_TOC1在夜间达峰，而chr02.374_LHY/CCA1和chr02.1648_RVE8在白天达峰。持续光照明显降低了多个时钟相关基因的表达振荡幅度，但其相对时间顺序基本保持不变，表明持续光照是减弱而非完全消除时钟相关基因表达的时间组织。峰值表达时间映射显示顺序模式：RVE8在开灯后30分钟至1小时达峰，LHY/CCA1在开灯后约2小时达峰，三个PRR基因在14:30达峰，ZTL、一个PRR和ELF4在18:30达峰，GI、TOC1、另一个PRR和LUX在21:30关灯时达峰，ELF3在关灯后约1小时达峰。Y1H实验证实LHY/CCA1特异性结合PRR95启动子，TOC1结合LHY/CCA1启动子。双荧光素酶实验证明CCA1抑制PRR95启动子活性，TOC1抑制CCA1启动子活性，支持花生核心生物钟组分间保守的负调控关系。
3.4 RNA-Seq数据的RT-qPCR验证
选取11个光和生物钟相关基因进行RT-qPCR验证，包括LHY、CRY、SPA、PIF、PRR9、TOC1、RVE8、ZTL、ELF4和GI。RT-qPCR结果与RNA-Seq数据在各时间点和条件下高度一致，确认了这些基因的昼夜节律性，验证了转录组数据的可靠性。
3.5 共表达分析将光和生物钟调控因子与转运蛋白相关通路联系起来
将正常条件下FPKM>20的基因按表达模式聚类，每种花生类型形成8个表达簇。光和生物钟相关基因的聚类在两种花生类型间高度一致。光相关基因簇的GO和KEGG富集分析显示显著富集于光响应和生物钟通路，转运蛋白通路在KEGG分析中排名第三，提示转运过程与光周期调控可能存在关联。生物钟相关基因簇主要富集于RNA加工、翻译和核糖体相关通路。TOC1和ELF3所在簇的基因显著富集于蛋白质代谢、RNA加工和囊泡介导的转运通路。
3.6 水通道蛋白和SWEET基因表现出昼夜表达节律
在转运蛋白通路中鉴定出103个基因，选取37个高表达基因进一步分析。其中水通道蛋白基因chr07.897表达量特别高，具有明显的昼夜节律，白天达峰。32个开灯后上调的转运蛋白基因分为液泡氨基酸转运蛋白、铵转运蛋白、钾通道、镁转运蛋白、抗坏血酸铁还原酶、MATE外排家族蛋白、生长素外排载体、水通道蛋白（MIP家族）、线粒体载体、糖转运蛋白、NRT1/PTR家族蛋白和硫酸盐转运蛋白等功能类别。这些基因在白天表达较高、夜间较低，持续光照处理后节律振荡不同程度减弱。鉴定出84个水通道蛋白基因，分属PIP、TIP、NLM和SIP四个亚家族；49个SWEET基因。光相关基因簇重叠基因集中鉴定出多个PIP亚家族水通道蛋白基因和SWEET基因，其中4个SWEET基因和6个PIP基因表现出强烈的光响应表达模式。伪时间轨迹分析显示这些转录因子与SWEET和水通道蛋白基因在光/暗循环中具有协调的动态表达模式。
3.7 候选调控基因表现出组织特异性表达和光响应启动子活性
RT-qPCR分析显示，SWEET基因（chr08.2947、chr07.2532）和生物钟/光相关转录因子基因（LHY/CCA1、MYB、PIF）优先在叶片中表达。水通道蛋白基因（chr03.178、chr08.1447）主要在复叶叶枕中表达，提示其参与膨压驱动的小叶运动。MYB基因chr15.2534在复叶叶枕和小叶叶枕中均优先表达，被鉴定为候选叶枕富集调控因子。双荧光素酶实验显示SWEET、PIP水通道蛋白、LHY/CCA1、MYB和PIF的启动子均表现出光响应活性，在叶片光照半区活性高于遮荫半区。
3.8 LHY/CCA1调控关键基因表达，包括MYB转录因子、水通道蛋白和SWEET转运蛋白基因
双荧光素酶实验显示，两个MYB（MYB-15.2534和MYB-08.1369）和PIF-07.456显著诱导SWEET_07.2532启动子活性；两个MYB（MYB-05.1144和MYB-08.1369）显著诱导SWEET_08.2947启动子活性；CCA1（CCA1-02.347）和三个MYB显著诱导PIP_08.1447启动子活性。Y1H实验确认三个MYB和CCA1-12.452与PIP和SWEET基因启动子直接互作，CCA1一致性地结合SWEET_07.2532、SWEET_08.2947和PIP_08.1447启动子。PIF在双荧光素酶实验中增强SWEET和PIP启动子活性但Y1H未检测到直接结合，可能反映间接调控或实验系统差异。在chr07.2532_SWEET、chr08.2947_SWEET和chr15.2534_MYB启动子中检测到EE（Evening Element）基序，Y1H实验确认LHY/CCA1结合这些区域，EE基序突变后结合消失。EMSA实验证实MBP-CCA1-2.374蛋白与SWEET-08.2947和MYB-15.2534启动子中的野生型EE探针产生明显迁移条带，突变EE基序后信号大幅减弱或消失，竞争探针显著削弱迁移条带，证明CCA1在体外直接且特异性结合这些启动子中的EE基序。
四、讨论与结论
4.1 光和生物钟基因驱动叶片节律性运动
感夜性叶片运动受外部光信号和内部生物钟共同调控。PHY和CRY等光受体检测昼夜信号并帮助校准生物钟。花生叶片中生物钟相关基因在持续光照条件下仍继续循环表达，支持内源振荡器驱动感夜性运动的存在。花生中AhLHY/CCA1在黎明达峰，AhTOC1在黄昏达峰，与拟南芥生物钟网络一致，表明保守的光-时钟系统调控节律性叶片运动。
4.2 SWEET和水通道蛋白基因在膨压相关过程中的潜在作用
感夜性叶片运动由运动细胞膨压变化驱动，需要水和溶质的协调转运。水通道蛋白是控制水跨膜流动的水通道蛋白。在雨树中，水通道蛋白在叶片运动阶段更活跃，帮助运动细胞快速调整体积。花生AhPIP基因表现出明显的昼夜表达变化，白天高表达与叶片展开同步。SWEET基因的昼夜表达模式可能影响局部糖分布和渗透条件。Y1H和双荧光素酶实验支持生物钟相关转录因子与SWEET和水通道蛋白基因之间的转录调控关联。这些结果与近期花生叶枕表达离子通道基因的证据共同表明，离子、糖和水转运与感夜性运动协调相关。研究将叶枕渗透运动模型扩展为鉴定出光响应和生物钟响应的SWEET和水通道蛋白候选基因，但这些基因是否直接参与花生运动细胞的周期性膨大和收缩仍需生理学和遗传学验证。
4.3 研究结论
本研究通过整合时间序列转录组分析、光周期处理和表达分析，系统解析了花生感夜性叶片运动的分子调控网络。研究鉴定了保守的光信号和生物钟相关基因及其节律性表达模式，揭示了LHY/CCA1、PRR95和TOC1之间保守的负调控关系。共表达分析将光信号和生物钟调控因子与转运蛋白相关通路联系起来，鉴定出具有昼夜节律表达模式的SWEET和水通道蛋白基因。组织特异性表达分析确定了叶枕富集的MYB转录因子作为候选调控因子。通过Y1H、双荧光素酶和EMSA实验，证实了LHY/CCA1通过直接结合EE基序调控MYB、SWEET和水通道蛋白基因的表达。研究提出一个工作模型：光受体和生物钟协调调控转运蛋白和调控基因的表达，可能通过调节糖和水转运参与花生感夜性叶片运动。这些发现为豆科植物感夜性运动的功能研究提供了分子框架，对理解植物环境适应和生产力优化具有广泛意义。该论文发表在《aBIOTECH》。
